점막 천포창 진단을 위한 결막 생검 및 직접 면역형광 기법

만성 반흔성 결막염인 점막 유천포창의 진단을 위해 결막생검의 채택을 늘리려고 노력하고 있으며, 방치하면 실명을 유발할 수 있습니다. 환자 막의 면역 복합체 침착을 위한 결막 생검의 직접 면역형광 염색은 MMP를 진단하지만 전 세계 많은 센터에서 수행되지 않습니다. 현재 방법 논문은 결막 생검을 채취하고 샘플 전달 및 혈액 준비를 위해 카트리지로 채워진 최적의 절단 온도 매체를 사용하여 샘플 처리를 줄이는 기술을 설명합니다.

시작하려면 수술 현미경을 사용하여 국소 또는 국소 마취 하에 유천포창이 의심되는 환자의 양쪽 눈에서 생검을 계획합니다. 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻고 출혈, 흉터, 수술 후 국소 스테로이드 투여를 시작해야 할 잠재적 필요성 등 가능한 부작용을 명확하게 설명하십시오. 생검을 하기 전에 생리 식염수를 사용하여 카트리지를 세척하고 최적의 절단 온도 또는 각 눈에 별도로 OCT 배지를 채워 카트리지를 준비하십시오.

이제 선택한 눈(오른쪽 또는 왼쪽)에 검경을 놓습니다. 국소 프로파라카인을 도포한 후에도 환자가 여전히 통증을 느끼면 투베르쿨린 주사기에 1밀리리터를 사용하여 2% 리도카인 0.2밀리리터를 결막하에 주사합니다. 사지 겸자를 사용하여 공막에서 결막을 들어 올린 후 Westcott 가위로 길이 약 4-5mm, 너비 2-3mm의 선형 절제를 수행합니다.

전체 생검을 최적의 절단 온도 매체로 즉시 옮깁니다. 액체 질소 또는 드라이아이스를 사용하여 내장된 샘플을 스냅 동결합니다. 그런 다음 섭씨 80도에서 밤새 보관하십시오.

섭씨 20-25도로 유지되는 극저온 조절기를 사용하여 냉동 조직을 4-6마이크로미터 두께의 조각으로 절편합니다. 접착력을 보장하기 위해 양전하를 띤 폴리라이신 코팅 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 그런 다음 슬라이드를 알루미늄 호일로 싸서 염색될 때까지 섭씨 80도에서 보관합니다.

슬라이드를 실온에서 10분 동안 해동합니다. 그런 다음 항원을 보존하고 조직 손상을 최소화하기 위해 100% 차가운 아세톤에 조직을 10분 더 고정합니다. 이제 슬라이드를 OBS로 각각 5분 동안 세 번 헹구어 잔류 OCT 배지와 아세톤을 제거합니다.

희석된 접합 항체, 항-IgG, 항-IgA, 항-IgM 및 항-IgC3를 슬라이드 위에 도포합니다. 음성 대조군 슬라이드에 항체를 적용하지 마십시오. 이제 슬라이드를 섭씨 37도의 가습 챔버에서 45-60분 동안 배양합니다.

그런 다음 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 핵 시각화를 위해 DAPI를 포함하는 마운팅 매체를 사용한 대조염색. 마지막으로 각 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓고 20분 동안 경화시킵니다.

형광단 검출을 위한 488나노미터의 녹색 여기 필터를 포함하여 적절한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사합니다. 기저막은 PAS 염색을 이용한 결막 생검에서 확인되었으며, 상피 기저부에 연속적인 밝은 분홍색 띠로 나타났다. 직접 면역형광 양성은 기저막을 따라 밝은 녹색 형광으로 시각화되었습니다.

직접 면역형광 양성 생검은 면역글로불린 IgM, IgA 및 IgG에 대한 형광을 보였고, 음성 생검은 형광이 부족했습니다. 양성 대조군은 기저막에서 강한 녹색 형광을 보였습니다.