Mini-Stroke Murine Model에서 신경면역 상호작용의 분리 및 유세포 분석 평가

우리 연구의 범위는 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포 기능에 중점을 둡니다. 우리는 뇌졸중 병리학에서 상주 및 침윤 면역 세포의 법칙을 이해하는 것을 목표로 합니다. 현재 유세포 분석법은 면역 세포 기능과 신경염증의 상호 작용을 평가하는 데 널리 사용됩니다.

또한 면역 기술과 단일 세포 및 시퀀싱은 신경 면역 상호 작용에 대한 연구를 발전시키고 있습니다. 우리 연구실은 신경 면역 상호 작용에서 성상세포의 경로, 신경염증 과정에 대한 혈관 기여를 설명하는 데 중점을 둘 것입니다. 시작하려면 50밀리리터 주사기를 가져다가 끝에 26게이지 바늘을 부착합니다.

주사기에 식염수를 완전히 채웁니다. 마취된 마우스를 폼 보드에 바로 누운 자세로 놓습니다. 앞다리와 뒷다리를 펴고 26게이지 바늘을 사용하여 고정합니다.

톱니 모양의 엄지손가락 겸자를 사용하여 복부 피부를 잡고 측면 절개를 하여 간을 노출시킵니다. 갈비뼈 양쪽을 따라 잘라 심장을 노출시킵니다. 이제 26게이지 바늘을 좌심실에 삽입하고 우심원을 절단합니다.

주사기 플런저를 눌러 혈액이 배출되도록 합니다. 오라클에서 흘러나오는 혈액이 깨끗해질 때까지 관류를 계속하십시오. 마우스의 목을 베고 뇌를 추출한 후 마우스 강철 뇌 매트릭스로 옮기고 연속적인 2mm 두께의 각막 조각으로 절편합니다.

500마이크로리터의 소화 효소 혼합물을 12웰 플레이트의 각 웰에 도입합니다. 마이크로 겸자를 사용하여 경색 조직을 섬세하게 분리하고 소화 효소 혼합물로 옮깁니다. 마지막으로 안과용 가위로 조직을 가능한 가장 작은 조각으로 조각화하고 플레이트를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.

AP 1000 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 흡인하고 10회 분배하여 조직을 개별 세포로 해리시킵니다. 그런 다음 용액을 70마이크로미터 셀 스트레이너에 통과시킵니다. 칼슘과 마그네슘을 함유한 얼음처럼 차가운 HBSS로 12웰 플레이트와 세포 스트레이너를 반복적으로 헹굽니다.

이제 수집된 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁합니다.

원심분리 과정을 반복한 후, 펠릿을 150마이크로리터의 PBS에 다시 재현탁하고 현탁액을 96웰 둥근 바닥판으로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 다시 원심분리합니다. 원심분리 후 96웰 플레이트를 단단히 잡고 재빨리 뒤집어 상층액을 버립니다.

다음으로, PBS에서 세포 생존율 형광 다이를 1:100의 비율로 희석하고 희석된 염료 용액 150마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다. 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.

세포 표면 항체 칵테일을 자기 활성화 세포 분류 또는 최대 완충액으로 희석하고 세포를 세척하지 않고 항체 칵테일을 웰에 추가합니다. 섭씨 4도에서 15-20분 동안 배양한 후 추가로 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 원심분리하고 상청액을 버린 후, 펠릿을 150마이크로리터의 최대 완충액에 재현탁합니다.

현탁액을 1.5밀리리터 원심분리기 튜브 또는 5밀리리터 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다. 수동 방법 또는 온라인 패널 설계 도구를 사용하여 기기 구성에 따라 다색 유세포 분석 패널을 설계합니다. 패널에 세포 생존율 염료를 포함하여 데이터에서 생존 불가능한 세포와 파편을 제외합니다.

전방 산란 및 측면 산란 감지기 설정을 조정하여 관심 있는 셀이 올바르게 표시되고 적절하게 게이팅될 수 있는지 확인합니다. FSC 및 SSC 매개변수를 미세 조정하여 파편과 외부 소음을 제거합니다. FSC 면적 대 높이를 보여주는 도트 플롯에서 이중선과 단일 셀을 구별합니다.

생존 염료의 음성 신호를 사용하여 생존 가능한 세포를 분리합니다. 염색되지 않은 세포의 자가형광 대조군을 염색된 세포 양성 대조군과 비교하여 염색된 세포가 각 매개변수에 대해 적절하게 스케일링되었는지 확인합니다. 다색 세포 샘플을 분석하고 두 개의 색 도트 플롯을 검사하여 보정을 미세 조정합니다.

세포 집단이 서로 수직 또는 수평으로 정렬될 때까지 보상 설정을 위 또는 아래로 조정합니다. CD45 및 CD11B 신호를 활용하여 특정 발현 패턴에 따라 림프구, 미세아교세포, 골수 세포 및 성상세포를 구별합니다. 림프구를 식별하기 위한 참조 역할을 하기 위해 가짜 뇌 조직을 자가형광 제어로 사용합니다.

특정 표적을 분석하는 경우 뇌졸중 후 뇌 조직으로 FMO 대조군을 활용하십시오. 제어 데이터를 수집하여 저장합니다. 마찬가지로 샘플 데이터를 수집하여 저장합니다.

표적 세포 집단을 선택하고 5밀리리터 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관 또는 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 분류합니다. 500마이크로리터의 PBS를 첨가하고 수집 튜브를 헹구어 세포 생존력을 보존하고 펠릿 형성을 돕습니다. CCR7 양성 및 CD11c 양성 미세아교세포는 허혈성 뇌졸중 후 2일과 7일에 정량화되었습니다.

미세아교세포의 CCR7 발현은 가짜 대조군에 비해 2일째에 급격히 증가했으며 7일째에도 상승한 상태를 유지했습니다. CD11c 양성 미세아교세포는 유사한 추세를 따랐으며 2일째에 정점을 찍고 7일째에는 가짜보다 높게 유지되었습니다. 도트 플롯은 2일과 7일에 조밀한 CCR7 및 CD11c 신호를 보여주었습니다.

가짜 컨트롤의 희소 신호와 대조됩니다. 게이팅 전략은 CD11B 및 CD45 발현을 사용하여 미세아교세포 골수 세포와 림프구를 분리했습니다. 추가 마커는 생존 세포, 성상세포 및 림프구 하위 집합을 정의했습니다.