포유류 세포에서 Godanti Bhasma에 의해 유발된 식세포작용의 순차적 세포 이벤트 탐색

식세포가 이물질을 섭취하고 분해하는 식균 작용. 면역 방어에 매우 중요합니다. 이 복잡한 세포 과정을 효율적으로 모니터링하고 평가하려면 향상된 사용자 친화적인 방법이 필요합니다.

실시간 분해 이벤트를 캡처하고 광표백으로 인한 아티팩트를 방지하는 것은 식균작용 및 세포내 트래피킹을 정확하게 연구하는 데 있어 핵심 과제로 남아 있습니다. 형광 또는 합성 입자와 달리 당사의 프로토콜은 광표백, 최적화 또는 복잡한 준비 없이 식균 작용 단계를 직접 시각화할 수 있는 무표지 입자인 Godanti Bhasma를 사용합니다. 이러한 발견은 식세포 메커니즘을 해부하기 위한 재현 가능한 모델을 제공하여 소포 역학, 병원체 기능 장애, 면역 및 리소좀 장애에 대한 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위한 새로운 도구를 제공합니다.

우리는 성숙 식균체의 분자 조절자를 탐색하고, 질병 모델에서 식세포 기능 장애를 조사하고, 소포 역학 및 세포 내 트래피킹을 조절하는 잠재적인 약물을 스크리닝하는 것을 목표로 합니다. 시작하려면 Godanti Bhasma 또는 GB 분말의 무게를 정확히 100mg으로 측정하십시오. 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 10밀리리터에 분말을 현탁시킵니다.

현탁액을 완전히 소용돌이쳐 내용물을 혼합하고 혼합물을 1분 동안 그대로 두어 더 큰 입자가 바닥에 가라앉도록 합니다. 피펫을 사용하여 현탁액의 상위 5밀리리터를 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 5밀리리터의 전달된 GB 현탁액을 추가 세포 배양 작업을 위한 원액으로 라벨을 붙입니다.

현탁액을 세포에 추가하기 전에 입자가 고르게 분산되도록 다시 완전히 소용돌이치십시오. 3 10의 4승 3T3-L1 세포를 2밀리리터의 DMEM을 포함하는 35밀리미터 접시에 시드합니다. 세포가 70% 합류에 도달할 때까지 5% 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.

그런 다음 300마이크로리터의 GB 스톡 현탁액을 예열된 신선한 배양 배지 2밀리리터에 완전히 혼합합니다. 세포와 GB 현탁액이 들어 있는 배양 접시를 이미징 현미경의 스테이지 인큐베이터에 놓습니다. 현미경에서 10x 대물렌즈를 선택합니다.

밝기 버튼을 사용하여 명시야 조명을 켭니다. 그런 다음 DIGI ImagePlus 소프트웨어를 실행하고 적절한 카메라를 선택합니다. 캡처 버튼을 클릭하고 타임랩스 옵션을 선택합니다.

간격 시간을 5분으로 설정하고 마침 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 현미경 스테이지 이산화탄소 인큐베이터 내에서 16-24시간 동안 연속적으로 5분 간격으로 명시야 이미지를 캡처합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 캡처된 모든 이미지를 타임랩스 비디오로 컴파일합니다.

이를 통해 입자 내재화에서 완전한 분해에 이르는 식균 작용 단계를 식별할 수 있습니다. 96웰 플레이트에서 24시간 동안 세포를 성장시킨 후, GB 입자 스톡 현탁액을 완전히 혼합합니다. 각 웰에 30마이크로리터의 현탁액을 추가합니다.

GB 입자가 없는 웰을 음성 대조군으로 사용합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 24시간 동안 배양하여 액포 형성을 유도합니다. 중성 적색 용액을 준비하려면 중성 적색을 용해시켜 무혈청 DMEM에 밀리리터당 0.5mg의 용액을 만듭니다.

0.2마이크로미터 필터를 통해 용액을 여과합니다. 이미징을 위해 96웰 플레이트에서 배지를 제거합니다. 각 웰에 60마이크로리터의 필터 염료를 첨가한 후 플레이트를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

과도한 염료를 제거하기 위해 PBS로 웰을 세 번 세척합니다. 그런 다음 현미경 이미징을 진행합니다. 액포의 크기, 형태 및 수를 평가하기 위해 20x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 염색된 액포를 검사합니다.

바필로마이신 A1 원액을 제조하려면 100마이크로그램의 화합물을 50마이크로리터의 디메틸 설폭사이드에 녹입니다. 그런 다음 950마이크로리터의 DMEM으로 희석합니다. 작업 용액의 경우 1마이크로리터의 스톡을 1.6밀리리터의 DMEM에 희석하여 0.1나노몰의 최종 농도를 얻습니다.

작업 용액을 완전히 혼합하고 96웰 플레이트에 세포가 포함된 웰에 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 각 웰의 세포를 30마이크로리터의 GB 입자 현탁액과 함께 배양하여 액포 및 식체 형성의 억제를 연구합니다. 식체 산성화를 억제하려면 이전에 GB로 처리된 미리 형성된 액포가 있는 웰에 100마이크로리터의 바필로마이신 A1 작동 용액을 첨가하십시오. 모든 웰을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 24시간 동안 배양합니다.

각 웰에 60마이크로리터의 중성 적색 염료를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 PBS로 웰을 3회 세척하여 과도한 염료를 제거한 다음 현미경으로 액포 형성 및 산성화를 분석합니다. 배양된 세포를 50마이크로리터의 GB 현탁액으로 처리하고 표준 실험 조건에서 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 하룻밤 동안 배양합니다.

처리 후, 밀리리터당 1밀리그램 농도의 아크리딘 오렌지 용액을 세포에 첨가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 액포와 산성 소포 소기관을 염색합니다. 다음으로, 멸균 PBS로 세포를 세 번 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거하고 배경 형광을 줄입니다. 마지막으로, 20x 대물렌즈와 450 내지 492 나노미터의 청색 여기 필터 범위가 장착된 형광 현미경을 사용하여 염색된 슬라이드를 즉시 분석합니다.

액포 역학을 이해하기 위해 세포 형태와 아크리딘 오렌지 흡수를 평가합니다. GB 처리 30분 후, 3개의 3T3-L1 세포 표면에 부착된 입자가 관찰되었습니다. 입자 주위에 막 확장과 같은 컵이 나타나 입자 삼키기의 시작을 나타냅니다.

처리 후 12시간에, 세포 내부에서 GB 입자를 포함하는 큰 막 결합 액포가 관찰되었습니다. 타임랩스 이미징은 4.75시간 동안 단일 살아있는 세포에서 단계적 내재화 및 액포 형성을 보여주었습니다. 액포 내의 GB 입자는 시간이 지남에 따라 점진적으로 분해되었고 세포는 액포 회전율로 표시되는 정상적인 형태를 회복했습니다.

유세포 분석 결과 내재화된 Godanti Bhasma 입자는 배양 배지에 입자가 남아 있지 않고 24시간 이내에 완전히 분해되는 것으로 나타났습니다. 중성 적색 염색은 약한 리소좀 염색만 나타낸 대조군에 비해 세 세포주 모두의 GB 처리된 세포에서 유의미하게 더 높은 액포 산성화를 나타냈습니다. 아크리딘 오렌지 염색은 산성화를 나타내는 GB 3T3-L1 세포의 액포에서 주황색 적색 형광을 나타낸 반면, 처리되지 않은 세포는 녹색 형광만 나타냈습니다.

바필로마이신과의 병용 치료는 각각의 대조군에 비해 액포가 없음으로 입증된 바와 같이 3T3-L1 및 HeLa 세포 모두에서 액포 형성을 억제했습니다. 바필로마이신으로 처리한 후 중성 적색 흡수가 효과적으로 차단되어 세포의 액포 산성화 및 성숙을 방해했습니다.