강기슭 딱정벌레와 수생 딱정벌레 사이에서 MOTU(Molecular Operational Taxonomic Units)를 생성하기 위한 혼합물 파이프라인

MEGA 다양한 열대 지방에서 종 발견 속도를 높이기 위해 이 프로토콜은 컴퓨터 기반 분석의 혼합을 사용하여 수생 및 강변 딱정벌레에서 종 클러스터링 가설을 생성하는 것을 목표로 합니다.

COI DNA 서열을 활용한 이 혼합물 파이프라인은 이전에 형태학적 데이터만 사용하여 세워졌던 Anisostena 속의 뗏목 딱정벌레에 대한 종 구분에 대한 더 큰 증거로 이어졌습니다.

이 프로토콜은 곤충 계통학의 황금 표준으로 간주되는 형태학 기반 분류학을 통한 종 발견이 종종 시간이 많이 걸리고 연구가 부족하지만 MEGA가 다양하고 매우 눈에 띄지 않는 수생 딱정벌레에게 혼란을 주는 분류학적 장애물을 해결하고자 합니다.

[임마누엘] 이 파이프라인은 서열이 참조된 서열에 따라 알려진 종과 일치하는지 또는 종이 발견되지 않았거나 설명되지 않았는지 여부에 관계없이 MOTU라는 분자 부속 가설을 생성합니다.

이를 통해 파이프라인은 수백 개의 딱정벌레 생식기 구조를 한 번에 해부하고 비교하는 대신 표본의 동종성을 면밀히 조사할 수 있는 예비 클러스터링을 제공합니다.

[해설자] 시작하려면 MEGA X를 실행하고 정렬을 위해 DNA 서열을 로드합니다. 선을 선택한 다음 편집 또는 정렬 작성을 클릭하고 새 정렬 만들기를 선택하여 정렬 인터페이스를 엽니다. 확인을 클릭하여 선택을 확인하고 데이터 유형으로 DNA를 선택합니다. 편집 탭 위에 마우스를 놓습니다. 파일에서 시퀀스 삽입을 클릭합니다. 적절한 디렉토리로 이동하여 MEGA에 로드할 시퀀스 파일을 선택합니다. 이제 정렬을 클릭한 다음 ClustalW로 정렬을 선택하여 기본 설정을 사용하여 시퀀스를 정렬하고 확인을 클릭하여 계속 진행합니다. 시퀀스를 수동으로 편집하려면 삽입된 베이스 또는 위치를 클릭하고 키보드의 삭제 키를 눌러 삽입을 삭제합니다. 그런 다음 누락된 베이스를 나타내는 대시를 클릭하고 제거한 다음 의도한 베이스를 입력하여 삭제를 수정합니다. 그런 다음 모든 시퀀스에 문자가 포함된 가장 빠른 위치를 찾습니다. 이 위치 바로 왼쪽에 있는 행 머리글의 빈 상자를 클릭하고 드래그하여 초과 시작 위치를 모두 선택합니다. 삭제 키를 눌러 트리밍합니다. 그런 다음 마지막으로 정렬된 위치를 찾아 이 지점 오른쪽에 있는 상자를 클릭합니다. Delete를 다시 눌러 끝을 다듬습니다. 이제 모든 서열을 선택하고 번역된 단백질 서열 탭을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 유전 코드가 무척추동물 미토콘드리아인지 확인합니다. 유전 코드가 다른 경우 아니오를 클릭하면 메뉴가 나타나 무척추 동물 미토콘드리아 유전 코드 확인란을 선택할 수 있습니다. 정렬에서 별표로 표시된 정지 코돈이 전체 열에 나타나면 DNA 서열을 클릭하고 모든 서열의 첫 번째 위치를 삭제합니다. 다시 DNA 서열을 클릭한 다음 정렬을 .mos 또는 .mosx 형식으로 저장합니다. TaxonDNA 모듈을 사용하여 구분을 시작하려면 TaxonDNA 소프트웨어를 엽니다. 가져오기를 클릭한 다음 FASTA를 선택하고 정렬 파일을 FASTA 형식으로 업로드합니다. 이제 모듈을 클릭한 다음 클러스터를 선택합니다. 임계값을 3%로 설정하고 모든 클러스터에서 개별 정보 생성 확인란을 선택합니다. 지금 클러스터 만들기를 클릭하여 클러스터링을 시작하고 스크린샷을 찍어 결과를 저장합니다. Kimura 2-Parameter 방법을 사용하여 구분하려면 MEGA를 열고 파일을 클릭한 다음 파일 또는 세션 열기를 선택합니다. 거리를 클릭합니다. 쌍별 거리 계산을 선택하고 구분을 위해 .meg 파일을 확인합니다. 모델 또는 방법 옆의 상자 위로 마우스를 가져간 다음 화살표를 클릭하여 드롭다운 메뉴를 확장합니다. Kimura 2-Parameter 모델을 선택하고 확인을 클릭하여 프로그램을 실행합니다. 데이터 출력 창을 열어 결과를 봅니다. 파일을 클릭한 다음 내보내기 및 인쇄 거리를 선택하여 결과를 저장합니다. 자동 분할 또는 ASAP 웹 서버를 통해 어셈블 종을 엽니다. 파일을 선택하고 .fasta 파일을 업로드하는 주황색 상자를 클릭합니다. 아래로 스크롤하여 이동을 클릭합니다. 클러스터링 결과를 다운로드하려면 ASAP 점수가 가장 낮고 P-값 순위가 가장 높은 행의 목록을 클릭합니다. 그런 다음 트리 추정을 시작하려면 MEGA를 열고 데이터를 클릭합니다. 그런 다음 파일 또는 세션 열기를 선택하여 .meg 파일을 로드합니다. 모델을 클릭한 다음 최상의 DNA 및 단백질 모델 찾기 또는 ml을 선택하여 가장 적합한 치환 모델을 결정합니다. 분석 기본 설정 메뉴에서 확인을 클릭합니다. 이제 트리를 생성하려면 계통 발생을 클릭한 다음 구성 및 최대 우도 트리 테스트를 선택합니다. 모델 또는 방법 옆에 있는 상자를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 적절한 모델을 선택하여 가장 적합한 대체 모델을 사용합니다. 계통 발생 테스트에서 계통 발생 테스트 옆에 있는 상자를 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 부트스트랩 방법을 선택합니다. 부트스트랩 복제 수 옆에 있는 상자를 클릭합니다. 1,000을 입력하고 확인을 클릭하여 분석을 실행합니다. 결과 트리가 포함된 창이 열리면 세션을 .mts 또는 .mtsx 파일로 저장합니다. 또한 출력을 .newick 파일로 저장하고 트리를 .png 이미지로 내보냅니다. PTP 기반 구분은 PTP 웹 서버를 방문하십시오. 파일 선택을 클릭하고 Newick 형식으로 트리를 업로드합니다. 내 트리 아래에서 뿌리를 뽑습니다. 외곽군 분류군 이름 아래의 상자에 분류군 팁의 이름을 입력하여 외군을 입력합니다. 그런 다음 최대 가능성 솔루션에서 구분 결과 다운로드를 클릭하여 PTP ML 출력을 저장합니다. 마찬가지로 가장 높은 베이지안 지원 솔루션에서 구분 결과 다운로드를 클릭하여 PTP BI 출력을 저장합니다. MPTP에 의한 MPTP 기반 제한은 MPTP 웹 서버를 방문하십시오. Newick 파일을 회색 사각형으로 드래그하거나 사각형을 클릭하여 업로드합니다. 데이터가 로드되면 아웃그룹 선택으로 진행을 클릭합니다. 외군 사양 페이지에서 외군 표본의 분류군 레이블 옆에 있는 확인란을 클릭하여 외군을 선택합니다. 그런 다음 모델 선택을 클릭하고 MPTP를 선택한 다음 시각화 옵션을 클릭합니다. 시각화 옵션 페이지에서 기본 설정을 적용합니다. 제출을 클릭합니다. 다운로드 가능한 파일 아래의 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택하여 결과를 저장합니다. 이제 분자 작동 분류 단위 또는 MOTU를 생성하려면 사진 편집 프로그램이나 PowerPoint를 사용하여 트리를 엽니다. 각 분자 종 구분 접근 방식의 결과를 나타내는 막대를 만듭니다. 모든 접근 방식이 주어진 분자 클러스터에 대해 동일한 결과를 산출하는 경우 합의에 의해 클러스터를 MOTU로 지정합니다. 이 그림은 COI 3-소수 서열과 6가지 구분 방법을 기반으로 한 보라누스 딱정벌레에 대한 최대 우도 유전자 트리 및 분자 클러스터링 결과를 나타냅니다. 모든 방법은 방법 전반에 걸쳐 동일한 클러스터링으로 4개의 MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini Byrrhinus A 및 Byrrhinus B를 일관되게 식별했습니다. Byrrhinus negrosensis와 Byrrhinus villarini는 같은 위치에서 유래했음에도 불구하고 명확하게 분리되었습니다. 4개 지방의 서열은 Byrrhinus A로 그룹화되어 강력한 지리적 구조를 보여주지 않았습니다. 이 그림은 Anisostena 딱정벌레를 Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A 및 Anisostena B를 포함한 4개의 MOTUS로 클러스터링하는 것을 보여주며 방법 전반에 걸쳐 완전히 일치합니다. Anisostena auxilium은 Anisostena A 및 Anisostena B와 지리적으로 겹쳤으며, 이는 지리학만으로는 분자 발산을 설명할 수 없음을 나타냅니다.