생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

우리는 뇌가 인지 유연성을 유지하기 위해 기억을 능동적으로 지우거나 억제하는 방법을 밝히는 것을 목표로 자연 기억 망각의 분자적, 세포적 및 회로적 기초를 이해하려고 노력하고 있습니다. 최근 연구에 따르면 망각은 단순히 기억의 수동적 붕괴가 아니라 특정 패턴의 신경 활동을 필요로 하는 고도로 조절된 능동적인 생물학적 과정입니다.

주요 과제는 특정 회로 조작을 동적 기억 프로세스에 연결하는 동시에 연결체, 유전 및 행동 데이터를 엄격하고 해석 가능한 방식으로 통합하는 것입니다. 우리는 망각이 생물학적으로 조절되는 활성 과정이라는 것을 확립하는 데 도움을 주었습니다. 우리의 연구는 초파리 뇌의 정상적인 망각에 필요한 특정 도파민성 뉴런과 분자 경로를 확인했습니다. 우리의 프로토콜은 마취 없이 파리의 기능적 이미징을 가능하게 하여 마취제에 의한 원치 않는 비특이적 효과를 방지합니다. 우리는 이 접근 방식을 사용하여 기본 기억 형성과 활성 기억 망각의 신경 상관 관계를 조사합니다.

[해설자] 시작하려면 Dremel 도구와 다이아몬드 톱날을 사용하여 22게이지 피하 금속 튜브를 약 10cm 길이로 절단합니다. Dremel 420 컷오프 휠을 사용하여 튜브의 양쪽 끝을 버핑하여 파리의 코를 수용할 수 있는 매끄럽고 깨끗한 개구부를 만듭니다. 절단된 튜브를 15밀리리터 원심분리기 튜브 주위에 감아 원하는 곡선 모양을 만듭니다. 그런 다음 7cm 길이의 12게이지 피하 금속 튜브를 자릅니다. 이제 면도날을 사용하여 22게이지 금속 튜브에 맞게 2마이크로리터 피펫 팁의 끝을 다듬습니다. 12게이지 튜브를 피펫 팁의 다른 쪽 끝에 끼웁니다. 다음으로 소량의 에폭시 수지와 경화제를 함께 혼합합니다. 작은 금속 튜브가 피펫 팁과 만나는 접합부와 큰 튜브가 다른 쪽 끝에 연결되는 접합부에 에폭시를 도포합니다. 어셈블리를 마이크로 매니퓰레이터 홀더에 연결하고 필요에 따라 각도를 조정하기 전에 에폭시가 밤새 완전히 경화되도록 하십시오. 충격 및 냄새 전달 피펫을 만들려면 Dremel 다이아몬드 도구를 사용하여 1 x 1 유리 피펫에서 100밀리리터를 3밀리리터 표시로 잘라냅니다. 그런 다음 24.5mm x 8mm 크기의 작은 직사각형 아크릴 시트를 1/8인치 두께로 자릅니다. 직사각형 아크릴 조각에 맞도록 구리 충격 그리드를 자릅니다. 구리 그리드의 반대쪽 끝에 두 개의 전선을 납땜합니다. 이제 아크릴 조각 위에 구리 격자를 놓고 파리의 복부와 다리에 맞도록 약간 구부립니다. 전기 테이프를 사용하여 구리 그리드를 아크릴 조각에 부착합니다. 그런 다음 글루건을 사용하여 유리 피펫을 쇼크 그리드에 부착하여 직선이 있고 중앙에 있는지 확인합니다. 기록 챔버를 구축하려면 유리 현미경 슬라이드를 챔버 베이스로 사용합니다. 수지와 에폭시 접착제를 함께 섞습니다. 에폭시 접착제를 사용하여 검은색 아크릴 챔버의 네 모서리 모두에 네오디뮴 자석을 부착합니다. 접착된 각 자석 위에 추가 자석을 놓습니다. 그런 다음 새로 배치된 자석을 에폭시를 사용하여 유리 슬라이드에 붙입니다. 경화하는 동안 클립으로 어셈블리를 제자리에 고정합니다. 흡인기에서 200마이크로리터 피펫 팁을 제거합니다. 초파리가 들어 있는 바이알에 흡인기를 삽입하고 플라이 한 마리를 1,000마이크로리터 피펫 팁으로 흡인합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 흡인기에 다시 교체합니다. 그런 다음 흡인기를 부드럽게 불어넣고 튕겨 플라이가 200마이크로리터 피펫 팁 상단에 머리부터 고정되도록 합니다. 그런 다음 해부 챔버를 조작기 홀더 위에 놓습니다. 진공청소기를 플라이 고정 튜브에 연결하고 유속을 분당 약 500밀리리터로 조정합니다. 이제 진공 금속 튜브를 현미경 시야 중앙으로 이동합니다. 파리를 코를 진공 홀더로 부드럽게 흡인합니다. 파리의 머리가 챔버 개구부에 맞도록 조작기를 조정합니다. 직류 전원 공급 장치를 켭니다. 백금 저항선을 사용하여 녹인 미리스틴산을 바르고 눈과 흉부를 챔버에 붙입니다. 고정되면 진공 튜브를 분리합니다. 매니퓰레이터를 사용하여 진공 연결부에서 기록 챔버를 제거하고 챔버를 거꾸로 뒤집습니다. 그런 다음 백금 저항을 사용하여 아래에서 코를 붙입니다. 모든 것이 접착되면 직류 전원 공급 장치를 끕니다. 그런 다음 챔버를 똑바로 세웁니다. 챔버를 유리 슬라이드 베이스에 부착합니다. 가위로 작은 테이프 조각을 잘라 파리의 머리 앞뒤에 놓습니다. 파리의 머리가 실험자를 90도 각도로 향하도록 챔버를 회전시킵니다. 해부 바늘로 눈 옆을 따라 수직으로 절개합니다. 챔버를 수평으로 회전시킵니다. 그런 다음 큐티클을 가로질러 수평으로 자릅니다. 이제 파리의 머리 꼭대기에 100마이크로리터의 식염수를 추가합니다. 날카로운 집게를 사용하여 큐티클 창을 제거한 다음 집게로 남아 있는 지방이나 기관을 제거합니다. 준비된 플라이를 레이저와 침수 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경의 현미경 스테이지에 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 충격 그리드와 냄새 피펫의 위치를 조정하여 플라이가 충격 그리드에 올바르게 위치하도록 합니다. 코스 z 조정 손잡이를 사용하여 뇌의 z축을 스캔하고 관심 있는 뇌 영역을 찾습니다. 프레임 크기를 512 x 512 픽셀로 설정합니다. 맞춤형 또는 상업적으로 이용 가능한 냄새 전달 시스템을 사용하여 관심 뉴런에서 기록을 시작합니다. 녹화 시간을 2분으로 설정합니다. 사전 훈련 응답을 수집한 후 5분 후에 냄새 전달 시스템을 사용하여 훈련 프로토콜을 시작합니다. 그런 다음 훈련 후 약 5-15분 후에 훈련 후 반응을 기록합니다. 칼슘 지시약인 GCaMP6f와 적색 형광 단백질인 tdTomato는 버섯체의 감마 및 알파 대시 엽으로 돌출된 수상돌기가 있는 버섯체 출력 뉴런에서 선택적으로 발현되었으며, MB077C 분할-GAL4 드라이버 라인을 사용하여 뉴런을 시각화했습니다. 3-옥탄올에 대한 버섯체 출력 뉴런의 칼슘 반응은 마취 없이 역방향 컨디셔닝 후 5분 후에 유의하게 감소했으며 15분에도 억제된 상태로 유지되었습니다. 대조적으로, 4-메틸사이클로헥사놀에 대한 칼슘 반응은 훈련 후 5분에 유의하게 향상되었고 15분에도 상승된 상태를 유지했습니다. 유사 색상 이미지는 훈련 전후에 뚜렷한 형광 변화를 보여주었습니다. 마취된 파리에서 CS+에 대한 훈련 후 칼슘 반응은 부분적으로만 감소했으며 CS-에 대한 반응은 기준선과 크게 다르지 않았습니다. 정량적 분석은 마취된 파리에서 훈련 후 CS+ 반응이 유의하게 저하되었지만 CS- 반응은 통계적으로 변하지 않은 것으로 확인되었습니다. 가소성은 마취된 파리에 비해 마취되지 않은 파리에서 유의하게 더 높았습니다.