재사용 간 영상 도구: 간내 현미경을 위한 재사용 가능한 3D 프린팅 도구

이 절차의 전반적인 목표는 재사용 간 영상 도구(RHIT)를 특히 간 연구에서 고품질의 역동적인 생물학적 데이터를 포착하는 획기적인 도구로 선보이는 것입니다. 전통적인 과학적 방법은 통제된 실험에서 쥐를 연구해왔으며, 오랫동안 행동 관찰, 생리학적 모니터링, 유전 분석에 의존해 왔습니다. 이러한 연구의 복잡성은 종종 일관성 없거나 제한된 데이터 결과를 초래합니다.

많은 실험은 불완전하거나 해석이 어려운 데이터에 의존하는데, 예를 들어 빠르게 사라지는 저해상도 이미지의 짧은 섬광 때문에 장기적인 추세나 미묘한 변화를 포착하기 어렵습니다. RHIT를 도입하여 간 연구 및 그 이상을 위한 동적 고해상도 포획을 가능하게 합니다. 우리가 시연한 이 기술은 접근 가능한 재료와 널리 보급되는 3D 프린팅 기술을 활용한 맞춤형 영상 도구를 제작할 수 있게 합니다.

학술 및 자원 제한 환경에서 사용하도록 설계된 이 접근법은 고해상도 생체 영상을 지원하는 장치를 신속히 개발하고 배포할 수 있게 합니다. 저희의 재사용 간 영상 도구(RHIT)는 간 내 생체 현미경 검사 중 조직 안정성을 개선하기 위해 개발되었습니다. RHIT의 모듈형 설계는 다양한 크기의 쥐를 수용하며, 최소한의 생리적 교란으로 동적 대사 과정의 장기 영상 촬영을 지원합니다.

RHIT는 아크릴로니트릴, 부타디엔, 스티렌, ABS를 사용하여 단일 단계로 제작되며, ABS는 가벼운 무게, 열안정성, 기계적 내구성을 고려한 열가소성 소재입니다. 재료 밀도를 조절함으로써 RHIT는 호흡과 심장 박동에 의한 움직임을 효과적으로 흡수하여 이미지 아티팩트를 줄이고 선명도를 향상시킵니다. ABS의 화학적 불활성 및 물 불용성 덕분에 생물 조직과의 가용성을 보장하고 효율적인 세척 및 재사용이 가능합니다.

RHIT를 재현하려면 3D 제품 설계 소프트웨어를 사용하세요. 이 설계에는 Autodesk Inventor가 사용되었습니다. Autodesk Inventor를 열고 새로운 표준 부품을 만드세요.

적절한 설명과 함께 파일을 저장하세요. 2D 스케치 만들기 기능을 사용해 전면 평면에서 RHIT 스케치를 만듭니다. 직사각형 아이콘을 클릭해서 그 왼쪽 아래 모서리를 스케치 평면의 원점에 위치시킵니다.

첫 번째 사각형 안에 RHIT의 영상 창을 나타내는 두 번째 직사각형을 그리세요. 치수 기능을 사용해 두 직사각형에 치수를 추가하여 모든 길이와 너비가 원점과 서로 상대적으로 참조되도록 하세요. 마우스 크기에 맞춰 RHIT 크기를 조정하세요.

RHIT에 두께를 추가하여 외부 직사각형만 선택한 후, 익스트루드 도구로 스케치를 압출하여 중앙에 빈틈을 남겨두세요. 압출된 RHIT의 하단 면을 선택하고 시작 2D 스케치 기능을 사용해 새 2D 스케치를 시작합니다. 히트 패드 포켓을 정의하는 직사각형을 그려보세요.

이 슬롯에 삽입할 히트 패드의 크기와 두께를 기준으로 직사각형의 크기를 정의하세요. 이 측정값들은 포유류의 정확한 온도 모델링을 위해 사용되는 물리적 히트 패드와 일치해야 합니다. 치수 기능을 사용해 필요한 치수를 적용하세요.

2D 스케치를 종료하고 컷 익스트루드 도구를 사용해 히트 패드를 위한 깊은 공동을 만듭니다. 스케치를 정확히 위치시키기 위해 필요에 따라 확대하세요. 공동과 같은 면에 온도 프로브의 새 스케치를 시작하세요.

2D 스케치 시작을 클릭하고 원 아이콘을 선택하세요. 원을 평면 위에 놓고 그에 맞게 크기를 정하세요. 스케치 모드에서 나가세요.

'extrude'를 클릭하고 원의 스케치를 선택하세요. 압출 모드에서 절단, 압출, 재료 제거를 클릭하세요. 포켓 인서트가 있는 얼굴 오른쪽에 원을 넣으세요.

아직 중앙에 맞출 필요는 없습니다. RHIT 두께의 중심과 일치하도록 치수를 추가하세요. 눌러, 엑스트루드.

컷 방향을 보여주는 화살표와 함께 '전체 통과' 옵션이 표시되는 팝업이 나타납니다. 전체 재료를 자르기 위해 모든 것을 선택한 후 확인을 클릭하세요. 압출 모드 종료.

창의 가장자리에 필렛을 추가하려면 필렛 아이콘을 클릭하고 8개의 날카로운 모서리를 모두 선택하세요. 필렛 크기를 추가하고 필렛 모드를 종료하세요. 환경 탭으로 이동해 3D 프린팅 탭을 선택하여 모델을 3D 프린팅 준비하세요.

수정되지 않은 RHIT를 출력하려면, 그림 1A 또는 보조 재료에서 STL 파일을 3D 프린팅 준비 소프트웨어로 가져오세요. 가져오기를 클릭하고 파일을 선택한 후 준비를 클릭해 모델을 인쇄 가능한 레이어로 슬라이스하세요. 호환되는 상업용 3D 프린터를 선택하고 출력을 클릭하세요.

인쇄 과정을 모니터링하세요. 완성되면 인쇄된 RHIT를 조심스럽게 제거하고 필요에 따라 청소하세요. 박출 후 10분에서 15분 정도 기다린 후 수술과 영상 촬영을 시작하세요.

현미경 준비와 RHIT 활용. 그림 2A에 나타난 대로 간 IBN용 기존식 역방향 공초점 현미경을 준비합니다. 샘플을 장착할 수 있도록 스테이지 어댑터를 삽입하세요.

이 프로토콜을 위해 35밀리미터 원형 개구부와 40밀리미터 커버 글라스가 있는 맞춤형 금속 인서트가 사용되었습니다. 촬영 전후에 커버 유리 양면을 철저히 청소하며, 필요에 따라 70% 에탄올을 사용하세요. 마우스 크기에 따라 적절한 RHIT를 테이프로 고정하려면, RHIT 조리개를 그림 2G에 보이는 것처럼 이미지 덮개 슬립과 평행하게 대물렌즈에 맞추고, 금속 인서트에 테이프를 붙여 테이프를 붙여 고정합니다.

25X per 95 물 대물렌즈와 같은 면적 크기, 공간 해상도, 촬영 시간을 기준으로 촬영용 대물렌즈를 선택하세요. 대물렌즈를 커버 유리 가까이에 맞추세요. 젖은 창문에 거즈 조각을 테이프로 고정하세요.

이렇게 하면 조직의 위치를 잡고 다른 복부 장기와 분리하는 데 도움이 됩니다. 슬롯에 삽입한 히트 패드를 사용해 RHIT를 예열하고, 그림 2G부터 H까지 RHIT 옆에 히트 프로브를 고정합니다. 이렇게 하면 영상 촬영 중 마우스의 체온을 유지할 수 있습니다. 복부 털은 제모 크림이나 제모 크림으로 면도하세요.

모발 잔여물을 제거하고 노출된 피부를 70% 에탄올로 소독하세요. 기관 IACUC 요구사항에 따라 적절한 수술 부위 준비를 위해 베타딘과 에탄올을 번갈아 세척하는 방법이 사용될 수 있습니다. 동물 수술 전에 마취 깊이를 재평가하세요.

흉골에서 외과적 가위로 갈비뼈 아래에 2에서 3센티미터 정도의 수평 초승달 모양 절개를 하여 간을 노출시키고, 상복부 왼쪽 외측에서 끝납니다. 초기 절개 후에는 근육층에 작은 2차 절개를 조심스럽게 하여 간 왼쪽 엽을 노출시킵니다. 출혈을 막기 위해 필요시 지혈하세요.

소작기를 사용할 때 간과 근육층 사이에 식염수가 적신 거즈를 놓아 근육에서 나오는 열을 흡수하여 간에 대한 열 손상을 방지합니다. 과도한 출혈, 수술 또는 기계적 외상, 외부 압박은 피하세요. 간이 노출되면 마우스를 현미경 단계로 옮깁니다.

마우스를 현미경 스테이지에서 위치시키는 것. 마취된 쥐의 복부를 현미경의 RHIT 플랫폼 위에 향하게 배치합니다. 마우스가 마취 상태에 머무르도록 코 콘을 조정하세요.

식염수에 적신 면 팁 어플리케이터를 사용해 간 왼쪽 외엽을 커버 슬립에 부드럽게 밀착시키고 흉강에는 외부 압력을 가하세요. 중력을 이용해 간을 조심스럽게 꺼내 덮개 유리 위로 옮기세요. 거즈 스트립을 사용해 간을 부드럽게 쥐 몸에서 분리하세요.

영상 촬영 중 쥐가 마취 상태에 있는지 코 콘을 다시 확인하세요. 노출된 충치 가장자리에 수성 젤을 바르고 온열 패드와의 직접적인 접촉을 피하여 조직 탈수를 예방하세요. 밀폐된 습도 챔버가 있는 현미경은 온도와 습도 유지에 도움을 줄 수 있습니다.

각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 눈에 바르세요. 마지막으로, 영상 촬영을 시작하기 위해 타임랩스 IVM을 설정하세요. 레이저 셔터를 열고 형광 표지를 평가하며, 눈에 띄는 혈류가 있는 안정적인 관심 영역을 식별합니다.

포맷, 속도, 영상 간격, 시간 길이, 프레임 평균 등 적절한 이미지 획득 방식을 선택하세요. 필요하다면 Z-스택의 상하 경계를 정의하고 타임랩스 녹화를 시작하세요. 프로토콜을 검증하기 위해 그림 3D에 보이는 구조적 유사성 지수(SIM)를 사용하여 이미지 안정성을 정량화했습니다.

SIM은 밝도, 명암, 구조 패턴을 기준으로 두 이미지를 비교합니다. 값이 1이면 완벽한 유사성을 나타내고, 0은 왜곡을 나타냅니다. 그림 3C는 RHIT가 인서트 없이 최대 50배까지 높은 SIM 값을 지속적으로 제공하여 우수한 화질을 보여줍니다.

A부터 C까지 표시된 이미지에서 안정제가 없는 간IVM, 판지 삽입 간, RHIT를 비교했습니다. RHIT는 마젠타 색상의 지질 방울, 녹색 색상의 핵, 청록색 색상의 혈관을 명확하게 유지합니다. 흑백 인셋이 이미지 안정성을 강조합니다.

RHIT는 영화 1에서 보듯이 비만 쥐에서 8시간 이상 장기 IBM을 가능하게 했습니다. 이 결과들은 RHIT가 여러 질환에서 영상 품질과 재현성을 크게 향상시킨다는 것을 확인시켜 주었습니다. 종합적으로 RHIT는 간형 IBM에 전통적으로 요구되던 복잡한 설정을 단순화하여 재현성과 접근성을 모두 향상시킵니다.

이 접근법은 첨단 영상 프로토콜의 표준화를 위해 3D 프린팅을 활용하는 더 넓은 움직임을 예견합니다. 간 영상을 넘어, RHIT의 설계 원칙은 장기 단층촬영, 재료 과학, 공학 등 영상 정확도에 중요한 운동 안정성 등 다양한 응용 분야로 확장될 수 있습니다.