액적 전달 방법을 사용하여 거대한 단층 소포를 안정적으로 준비

우리는 국소적으로 치료법을 투여하기 위해 신체 조직을 탐색하는 세포와 유사한 마이크로로봇을 목표로 합니다. 그들은 거대한 단층 소포와 인지질 막을 기반으로 하며 활성 입자를 포함합니다. 이 프로토콜은 합성 생물학 및 기타 분야(예: 마이크로로보틱스)에서 액적 전달 방법을 채택하고 적용하려는 초보자를 위한 가이드를 제공합니다.

다른 GUV 준비 기술과 비교하여 이 프로토콜은 높은 캡슐화 효율성과 간단한 실행을 제공하므로 기본 실험실 장비를 갖춘 모든 연구 그룹이 접근할 수 있습니다. 우리는 조직과 유사한 환경에서 GUV 기반 마이크로로봇의 탐색을 평가하고 병든 세포를 향한 자율적인 이동을 가능하게 하는 감지 전략을 구현할 것입니다. 시작하려면 장갑실을 화학 후드 내부 또는 옆으로 이동합니다.

장갑 챔버를 열고 챔버 바닥에 실리카 입자로 채워진 결정화기를 놓습니다. 결정화기를 흰색 지지 표면으로 덮은 다음 종이 타월로 겹겹이 쌓습니다. 필요한 모든 재료를 장갑 챔버에 삽입하고 클로로포름 용액이 들어 있는 유리 바이알을 코르크 링 홀더 또는 작업자 쪽에 최대한 가깝게 배치된 150밀리리터 비커에 놓습니다.

이제 장갑실을 닫고 두 반쪽이 단단히 정렬되고 미끄러지지 않도록 합니다. 제공된 플라스틱 나사를 사용하여 챔버를 완전히 밀봉하십시오. 출구 밸브를 닫고 5번 파이프를 물이 절반 채워진 500밀리리터 비커에 담그십시오.

그런 다음 파이프 번호 2의 밸브 조절 끝을 진공 라인에 연결합니다. 그런 다음 파이프 번호 3을 사용하여 다른 쪽 끝을 질소 라인에 연결합니다. 밸브를 열고 장갑이 팽창하고 너무 단단해져서 구부릴 수 없을 때까지 진공 라인을 켭니다.

그런 다음 진공 라인과 밸브를 모두 닫습니다. 그런 다음 장갑이 수축되어 장갑 챔버에서 확장될 때까지 질소 라인을 엽니다. 장갑을 착용한 후 해밀턴 주사기를 사용하여 클로로포름 용액에 담긴 지정된 부피의 DOPC를 어두운 유리 바이알로 옮깁니다.

바늘이 들어 있는 캡으로 바이알을 밀봉합니다. 이제 양방향 접합을 사용하여 파이프 번호 6을 파이프 번호 8에 연결하고 파이프 번호 7을 파이프 번호 9에 연결합니다. 장갑실에서 장갑을 제거하고 출구 밸브를 엽니다.

그런 다음 질소 라인을 천천히 열고 비커에 기포가 있는지 가스 흐름을 모니터링합니다. 꾸준하지만 관찰 가능한 버블링 속도에 도달할 때까지 질소 유량을 점차적으로 증가시킵니다. 3분 동안 흐른 후 질소 라인을 닫습니다.

최종 기포가 비커에서 빠져나가면 출구 밸브를 닫습니다. 장갑을 다시 끼고 양방향 접합부에서 파이프 8번과 9번을 분리합니다. 그런 다음 바이알을 열고 캡을 다시 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 오일 병을 열고 필요한 양의 오일을 어두운 바이알에 옮깁니다. 바이알을 다시 캡으로 밀봉하고 장갑을 제거한 다음 장갑실을 엽니다. 밀봉된 지질 현탁액 바이알을 최소 30초 동안 격렬하게 소용돌이치게 합니다.

그런 다음 섭씨 80도에서 수조에서 30분 동안 배양합니다. 바이알을 다시 소용돌이치게 한 후 실온에서 밤새 배양합니다. 가위를 사용하여 5밀리리터 튜브에서 캡을 잘라냅니다.

P1000 피펫 팁에 맞도록 캡 중앙에 약 8mm 구멍을 뚫습니다. 구멍이 너무 넓어서 팁에 맞지 않으면 캡을 버리고 새 캡으로 다시 시작하십시오. 2x5cm 크기의 사포 스트립으로 드릴 구멍의 가장자리를 매끄럽게 만듭니다.

캡을 5밀리리터 튜브에 다시 놓고 3, 000g에서 5분 동안 원심분리하여 잔류 플라스틱 입자를 제거합니다. 그런 다음 캡을 제거하고 튜브를 버립니다. 이제 새 5밀리리터 튜브에서 캡을 자르고 준비된 구멍이 뚫린 캡으로 교체합니다.

더 이상 아래쪽으로 움직이지 않도록 팁과 캡 사이에 O-링이 잠긴 구멍을 통해 P1000 팁을 삽입합니다. 팁을 통해 튜브에 5.5밀리리터의 외부 용액을 채웁니다. 최소 30초 동안 미리 준비된 지질 현탁액 바이알을 소용돌이치게 합니다.

그런 다음 섭씨 50도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 이전에 준비된 수용액이 실온에서 최소 10분 동안 평형을 이루도록 합니다. 이제 300마이크로리터의 외부 용액을 1.5밀리리터 튜브 또는 이전에 수정된 5밀리리터 튜브에 피펫팅합니다.

오일 용액 위에 100마이크로리터의 지질 현탁액을 천천히 겹쳐 두 개의 뚜렷하고 연속적인 상을 형성합니다. 평형을 이루기 위해 인터페이스를 10분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 2밀리리터 튜브에 250마이크로리터의 지질 현탁액을 피펫팅한 다음 6.25마이크로리터의 내부 용액을 피펫팅하여 2.5% 유중수 에멀젼을 준비합니다.

에멀젼이 균질하고 안정적으로 나타날 때까지 두 단계를 혼합합니다. 준비된 에멀젼 200마이크로리터를 이전에 형성된 오일 용액 지질 현탁액 계면에 옮깁니다. 1.5밀리리터 튜브를 사용하는 경우 튜브를 닫기만 하면 됩니다.

수정된 5밀리리터 튜브를 사용하는 경우 피펫 팁에 고무 캡을 씌우고 튜브 전체를 50밀리리터 원추형 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 튜브를 실온에서 적절한 속도로 원심분리합니다. 원심분리 후 바닥에 불투명한 펠릿이 있고 상단에 유상이 깨끗한지 확인합니다.

GUV가 들어 있는 5밀리리터 튜브에서 오일을 제거하려면 고무 캡이 제자리에 있는지 확인하면서 튜브에서 피펫 팁을 꺼냅니다. 팁을 버리고 나중에 사용할 수 있도록 고무 캡, O-링 및 홀드 캡을 보관하십시오. 대신 1.5밀리리터 튜브를 사용하는 경우 P1000 마이크로피펫을 사용하여 오일 용액을 제거하고 약 50마이크로리터를 남기고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.

피펫 팁을 교체한 다음 나머지 50마이크로리터의 용액에 펠릿을 재현탁합니다. 마지막으로 재현탁된 재료를 깨끗한 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 높은 습도 조건에서 준비된 지질 용액은 습도 제어 챔버에서 준비된 것에 비해 수율이 현저히 낮고 무질서한 응집체의 유병률이 더 높은 거대한 단층 소포를 생성했지만 일부 응집체는 여전히 후자에 존재했습니다.

3, 300g에서 20분 동안 자당이 함유된 소포의 수율과 품질은 최적이었지만, 더 낮은 원심분리 속도와 높은 원심분리 속도 모두 수율 감소 또는 응집체 형성과 같은 불리한 결과를 초래했습니다. 미네랄 오일은 평균 직경 분포가 더 큰 소포를 생성한 반면, 실리콘 오일 AR 20은 전체 소포 수가 훨씬 더 많았습니다.