라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

우리는 심근경색 후 면역 세포와 손상된 조직의 상호 작용을 살펴보고 있습니다. 우리는 면역 반응을 이해하고 심장 기능을 개선하는 것을 목표로 합니다. 심근경색 후 세 가지 주요 세포 개체인 심근세포와 세포 및 면역 세포를 모두 동시에 다중 표적 전략에 의해 조절되어야 한다고 제안되었습니다.

심장 손상 및 반응에 대한 동시 분석 외에도 이전에는 알려지지 않았던 이러한 손상 부위에 대한 3D 위치 파악을 보여줄 수 있었습니다. 3D 분석, 특히 다양한 표적을 다중화할 때 심근경색 후 세포 구성을 평가하는 보다 강력한 방법을 제공합니다. 시작하려면 안락사된 마우스를 실체 현미경 아래에 놓습니다.

가는 가위를 사용하여 흉강을 열고 흉곽에서 목까지 혈관 출구 가까이에서 노출된 상대정맥을 절개합니다. 롤러 펌프에 부착된 27게이지 바늘을 사용하여 헤파린이 함유된 PBS로 좌심방 신탁을 통해 심장을 제자리에서 관류합니다. 심장의 표재성 혈관 흡입의 퇴색과 폐와 간의 미백을 관찰하여 충분한 심장 혈액 제거를 확인합니다.

겸자와 가위를 사용하여 나머지 대동맥 및 주변 폐 조직의 최소 5mm와 함께 심장을 절제하고 얼음처럼 차가운 PBS와 거즈로 미리 채워진 6cm 페트리 접시에 옮깁니다. 이제 대동맥이 약 5mm인 심장만 남을 때까지 남은 폐, 지방 및 혈관 조직을 잘라냅니다. 심장을 대동맥 캐뉼라 삽입을 위해 준비된 접시로 옮기고 나머지 대동맥을 20게이지 무딘 강철 캐뉼라 위로 당깁니다.

예쁜 5-0 봉합사로 캐뉼라 노치에 고정합니다. 재관류 급성 심근경색의 유도에 사용되는 위치에 6-0 봉합사로 좌전하행동맥을 영구적으로 위임합니다. 삽입된 캐뉼라를 통해 역행적으로 LexaFluor 546으로 표지된 20마이크로그램의 마우스 NT CD31 항체를 포함하는 400마이크로리터의 PBS를 주입합니다.

대동맥에서 캐뉼라를 조심스럽게 빼내고 심장을 15밀리리터의 4% 파라포름알데히드 10밀리리터가 들어 있는 4밀리리터 폴리프로필렌 반응 튜브로 옮깁니다. 튜브를 교반하지 않고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 5밀리리터 폴리프로필렌 반응 튜브 내부에서 교반을 위해 거의 머리 위 회전을 사용하여 어둠 속에서 실온에서 각각 10분 동안 5밀리리터의 PBS를 세 번 교체하여 고정된 심장을 세척합니다.

고정된 심장을 탈이온수에 50% 에탄올 5밀리리터로 5밀리리터 실온에서 어둠 속에서 최소 2시간 동안 탈수하고, 5밀리리터 반응 튜브에서 거의 머리 위 회전으로 교반합니다. 탈수된 심장을 표백하려면 100% 에탄올 10ml와 5% 디메틸 설폭사이드 및 5% 과산화수소가 들어 있는 15ml 반응 튜브에 옮기고 교반하지 않고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 4시간 동안 배양합니다. 표백된 심장을 100% 에탄올 5밀리리터로 5밀리리터 반응 튜브에서 교반을 위해 거의 머리 위 회전을 사용하여 어둠 속의 실온에서 각각 12시간 동안 세 번 세척합니다.

심장을 4밀리리터의 에틸 신나메이트가 들어 있는 5밀리리터 반응 튜브로 옮기고 어두운 실온에서 3일 동안 교반하지 않고 배양합니다. 투명한 젤과 껌 블록을 현미경 샘플 홀더에서 투명한 심장을 안정화시키는 크기로 절단합니다. 이미지 획득을 위해 작동 거리가 17.6mm인 0.1 개구개 대물 렌즈를 사용하십시오.

그런 다음 적절한 여기 및 방출 필터 설정을 사용하여 형광 신호를 감지합니다. 라이트 시트 현미경 이미징의 경우 시트 개구수 0.079를 선택하면 라이트 시트 두께가 5마이크로미터가 됩니다. 두 개의 개별 Z 평면 사이의 거리를 10마이크로미터로 설정합니다.

100%의 시트 너비를 사용하여 샘플의 균일한 조명을 얻습니다. 다채널 항체 염색 및 자가형광을 사용하여 위험에 처한 영역, 내피 손상 및 침윤된 호중구를 국소화하는 대표적인 심장 절편이 이 그림에 나와 있습니다. 위험 부위는 역행성 주사 후 CD31 염색 부재, 정맥 CD31 음성에 의한 내피 손상 및 대부분 손상 부위 근처의 Ly6G 양성 반점에 의한 호중구 침윤으로 확인되었습니다.

3D 렌더링은 AAR, 내피 손상 및 호중구 클러스터 간의 중복을 보여 영역 특이적 면역 국소화를 시사합니다. 정량화 결과 AAR에서는 호중구의 90.2%가 나타났고 외딴 지역에서는 9.8%가 국소적인 염증을 나타냈습니다. AAR 내에서 호중구의 79.3%는 내피 손상 부피 외부에, 20.7%는 내부에 있었는데, 이는 손상 주변에 말초 군집이 있음을 시사합니다.