전립선암 관련 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

우리는 암 관련 섬유아세포가 치료 전략으로서 이러한 누화를 중화하는 것을 목표로 전립선암의 종양 진행에 기여하는 메커니즘을 이해하는 것을 목표로 합니다. 다양한 조작을 통해 종양 및 간질 세포를 사용하여 얻은 3D 오가노이드에서 서로 다른 특성을 가진 CAF의 뚜렷한 집단을 평가할 수 있습니다. 우리의 프로토콜을 사용하면 이러한 목적을 위해 CAF를 안정적으로 생성할 수 있습니다.

주요 과제는 동일한 환자의 미세 환경에서 종양 및 정상 세포를 안정적으로 분리하는 것, 이질성, 특정 CAF 마커의 부재, CAF의 가소성 및 TME 복잡성을 요약하는 제한된 시험관 내 모델입니다. 유사한 방법을 사용하여 쥐 유방암 CAF에서 전사 인자 STAT3 및 그 표적 유전자의 근본적인 전종양 역할을 특성화하여 치료 표적으로서의 효능을 입증했습니다. 소량의 조직을 사용하여 전립선암 환자로부터 얻은 근치적 전립선 절제술 표본의 종양 및 인접한 정상 영역에서 섬유아세포의 최적 분리.

시작하려면 섬유아세포 분리를 위해 첫날에 저울에서 조직 샘플의 무게를 측정합니다. 멸균 겸자를 사용하여 조직을 6cm 접시로 옮깁니다. 얼음으로 차가운 PBS 4밀리리터와 얼음으로 차가운 완전 DMEM 4밀리리터로 조직을 두 번 세척합니다.

이제 조직을 얼음 위의 6cm 접시로 옮깁니다. 항생제가 보충된 DMEM 1밀리리터를 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 가위나 칼날을 사용하여 조직을 1제곱밀리미터보다 작은 조각으로 잘게 썬다.

다진 조직을 5밀리리터의 얼음처럼 차갑게 완전한 DMEM이 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 754g에서 원심분리합니다. 10밀리리터 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다.

펠릿을 얼음처럼 차갑게 5밀리리터의 완전한 DMEM에 재현탁하고 다시 원심분리합니다. 상청액을 제거한 후 펠릿을 콜라게나제 II 용액에 재현탁합니다. 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로튜브에 옮깁니다.

마이크로튜브를 파라핀 필름으로 밀봉합니다. 그런 다음 섭씨 37도에 두어 밤새 소화하고 8-12시간 동안 계속 흔듭니다. 다음날 분해된 샘플을 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

콜라게나제를 비활성화하기 위해 얼음처럼 차갑게 5밀리리터의 완전 DMEM을 피펫팅합니다. 그런 다음 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 754g에서 원심분리합니다. 상청액을 피펫팅한 후 펠릿을 0.05% 트립신-EDTA 1밀리리터에 재현탁합니다.

가끔 흔들면서 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 새로 준비된 DNase I 용액 1밀리리터를 샘플에 피펫팅하고 잘 혼합합니다. 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 펠릿을 5밀리리터의 차갑게 완전 DMEM에 재현탁하고 다시 원심분리합니다.

생성된 세포를 20% 소 태아 혈청으로 보충된 완전한 DMEM에 재현탁합니다. 세포를 플레이트하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 및 95% 습도에서 최소 3일 동안 배양합니다. 3일 후, 세포의 형태와 생존력을 검사합니다.

세포가 합류에 도달하면 20% 소 태아 혈청이 포함된 완전한 DMEM이 들어 있는 10센티미터 접시에 세포를 통과시킵니다. 12웰 플레이트에서 70% 융합성의 플레이트 암 관련 섬유아세포 또는 정상 섬유아세포. 다음날, 멸균 조건에서 50밀리리터 원추형 튜브에 0.45g의 저융점 한천을 12.5밀리리터의 PBS에 첨가합니다.

전자레인지를 사용하여 혼합물을 녹입니다. 한천 용액을 섭씨 37도까지 식힙니다. 그런 다음 예열된 완전 DMEM으로 1:4 비율로 희석하여 작업 용액을 준비합니다.

12웰 플레이트에서 배지를 흡인합니다. 500마이크로리터의 작업 한천 용액을 각 웰에 피펫팅합니다. 한천이 응고될 수 있도록 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다.

한편, 남은 한천 용액은 섭씨 37도로 유지합니다. 종양 세포를 트립신화하고 밀리리터당 20, 000 세포의 세포 현탁액을 준비합니다. 동일한 부피의 종양 세포 현탁액과 한천 용액을 혼합하여 각 조건당 3번의 기술적 반복을 설명하는 7밀리리터의 최종 부피를 얻습니다.

균일한 혼합을 보장하기 위해 위아래로 여러 번 피펫팅합니다. 그런 다음 각 웰의 응고된 기층 위에 약 5, 000개의 세포를 포함하는 이 혼합물의 500마이크로리터를 분배합니다. 한천을 섭씨 4도에서 20분 동안 응고시킨 후 각 웰에 1밀리리터의 완전 DMEM을 추가합니다.

우물 가장자리에서 부드럽게 흡인하고 중앙에 신선한 배지를 추가하여 격일로 배지를 교체하십시오. 콜로니가 쉽게 보일 때까지 배양합니다. 콜로니가 보이면 배양 배지를 버립니다.

그런 다음 200마이크로리터의 니트로 블루 테트라졸륨 염화물 용액으로 콜로니를 염색합니다. 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 염색액을 버립니다.

실체 현미경을 사용하여 염색된 콜로니의 이미지를 획득합니다. 순수한 섬유아세포가 성공적으로 분리되었습니다. 많은 경우, 특히 초기 계대에서 암 관련 섬유아세포는 정상 섬유아세포에 비해 더 방추와 같은 형태를 보였습니다.

정량적 분석에서 암 관련 섬유아세포 조절 배지로 처리된 DU145 세포의 증식은 정상 섬유아세포 조절 배지로 처리하거나 처리하지 않은 채로 방치한 것보다 120시간 동안 유의하게 더 높았다는 것을 확인했습니다. 암 관련 섬유아세포 및 정상 섬유아세포와 직접 공동 배양된 DU145 세포도 대조군에 비해 96시간 동안 증식 증가를 보였습니다. 해당 성장 곡선은 암 관련 및 정상 섬유아세포와의 공동 배양이 시간이 지남에 따라 DU145 증식에서 유사한 증가를 초래한다는 것을 보여주었습니다.

DU145 증식에 대한 조건화된 배지의 효과는 암 관련 섬유아세포와 정상 섬유아세포 쌍에 걸쳐 다양했으며 초기 계대 쌍은 후기 쌍보다 훨씬 더 강한 효과를 보였습니다. 연한천 콜로니 형성 분석에서 암 관련 섬유아세포와 정상 섬유아세포 모두 대조군에 비해 DU145 콜로니의 수와 크기를 증가시켜 고정 독립적 성장이 향상되었음을 나타냅니다. 기술적 문제로 인해 형성된 분리된 섬유아세포층은 일부 복제에서 콜로니 형성을 방지했습니다.

조건화된 배지 단독으로는 DU145 세포에서 고정 독립적인 콜로니 형성을 촉진하지 않았습니다.