Long-Read Sequencing Technologies를 사용한 Amplicon Sequencing
August 29th, 2025
이 프로토콜은 긴 판독 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 결핵균 의 18개 약물 내성 영역에 대한 표적 심층 시퀀싱에 최적화되었으며, 이어서 장기 판독 데이터용으로 설계된 결핵 특이적 생물정보학 파이프라인으로 분석했습니다.
저는 휴대용 롱리드 시퀀싱이 자원 제한 환경에서 결핵 내성 감수성 결과를 골드 스탠다드 방법과 유사한 정확도로 제공할 수 있는지 조사하여 접근성 높고 고품질 결핵 진단을 발전시킬 수 있는지 연구합니다. 생물정보학 전문 지식 없이 임상 샘플에서 직접 포괄적인 내성 프로파일을 제공함으로써 약물 내성 결핵의 진단 도구로서 표적 차세대 시퀀싱을 활용합니다. 장기 독기 시퀀싱을 활용한 프로토콜은 실시간 내성 검출보다 더 빠른 처리 시간과 간단한 워크플로우를 제공하고, 최소한의 인프라로 자원이 제한된 환경에서 결핵 진단을 포괄적으로 지원하고 발병 추적을 강화할 잠재력을 가지고 있습니다.
우선, 각 암플리콘 샘플의 농도를 기준으로 100나노그램을 계산하고, 필요한 부피를 깨끗한 PCR 튜브로 옮깁니다. 샘플 내 증폭자의 총 질량을 결정하려면 주어진 공식을 사용한다. 뉴클레아제가 없는 물을 사용해 각 샘플의 총 부피를 12.5 마이크로리터로 조절하세요.
샘플을 10번 위아래로 부드럽게 섞은 후 마이크로 원심분리기에서 잠시 돌립니다. 다음으로, 각 샘플에 1.75마이크로리터의 말단 복구 및 아데닐화 반응 완충제를 첨가하고, 이어서 0.75 마이크로리터의 종단 복구 및 아데닐화 효소 혼합물을 추가합니다. 샘플을 혼합하고 회전시킨 후, 튜브를 25도 섭씨에서 30분간 가열한 후 65도 온도에서 30분간 가열합니다.
네이티브 바코드 리게이션을 위해서는 화면에 표시된 성분들을 새로운 PCR 튜브에 추가하세요. 피펫팅으로 반응을 부드럽게 섞고, 마이크로 원심분리기로 잠시 돌립니다. 다음으로 각 튜브에 1마이크로리터의 EDTA를 추가하세요.
그 다음, 앞서 보인 대로 충분히 섞고 잠깐 돌립니다. 바코드가 부착된 샘플을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 넣습니다. DNA 정화 비드를 보텍스로 만들어 완전히 재현탁시키고, 모인 샘플 부피의 0.7배에 해당하는 부피를 추가합니다.
구슬 샘플 용액을 섞어 HulaMixer에서 실온에서 10분간 배양하세요. 다음으로, 80% 에탄올 2밀리리터를 준비하기 위해 순수 에탄올 1,600마이크로리터와 뉴클레아제 무첨가물 400마이크로리터를 혼합합니다. 튜브를 자석 선반에 5분간 올려 세척액이 투명하고 무색으로 변할 때까지 보관하세요.
그 후 상원액을 제거하고 펠릿을 흐트러뜨리지 않고 버립니다. 구슬을 700마이크로리터의 신선하게 준비한 80% 에탄올로 세척한 후 튜브를 잠시 원심분리합니다. 튜브를 자기 랙에 올린 후 잔여 에탄올을 제거합니다.
이제 자기 랙에서 튜브를 빼세요. 구슬을 35마이크로리터의 뉴클레아제 무첨가물에 부드럽게 튕기며 다시 떠올리고, 37도 섭씨에서 10분간 배양합니다. 튜브를 다시 자석 랙에 넣어 희출액이 투명하고 무색이 될 때까지 유지하세요.
그 후 35마이크로리터의 엘루에이트를 깨끗한 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮겨 추가 사용을 합니다. 어댑터 연결을 위해서는 주어진 성분들을 1.5밀리리터 저결합 마이크로 원심분리관에서 혼합합니다. 튜브를 잠시 원심분리하고 실온에서 20분간 배양하세요.
DNA 정화 비즈를 보텍스로 완전히 재현지시킵니다. 튜브에 20마이크로리터의 비즈를 넣고 부드럽게 섞으세요. HulaMixer에서 실온에서 10분간 부양하세요.
그 후 튜브를 자석 선반에 올려 구슬을 넣고 펠릿을 방해하지 않고 상원액을 흡입합니다. 짧은 조각 완충제 125마이크로리터를 넣고 튜브를 살짝 튕겨 비즈를 다시 현지합니다. 잠시 원심분리기를 하고 튜브를 자기 거치대로 다시 넣으세요.
구슬이 알렉션된 후 상원액을 다시 흡인하세요. 이제 튜브를 자기 선반에서 분리하고, 부드럽게 피펫팅하거나 튕겨 15마이크로리터의 용출 버퍼에 비즈를 다시 고정하세요. 튜브를 잠시 원심분리하여 내용물을 수집한 후, 37도 섭씨에서 10분간 배양하여 DNA를 희석합니다.
튜브를 자석 선반에 올려 세척액이 투명하고 무색이 될 때까지 보관하세요. 그 다음 15마이크로리터의 루메이트를 흡입하여 깨끗한 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 플로우셀 프라이밍 용액을 준비하려면 주어진 성분들을 충분히 혼합하세요.
플로우셀의 프라이밍 포트를 열고 약 20마이크로리터의 버퍼를 흡입하여 기포를 제거하고, 공기 방울을 도입하지 않고 프라이밍 혼합액 800마이크로리터를 포트에 주입하세요. DNA 라이브러리를 준비하려면 화면에 표시된 성분들을 철저히 혼합하세요. 플로우셀의 샘플 포트 캡을 부드럽게 들어 올리고, 200마이크로리터의 프라이밍 혼합물을 공기방울을 넣지 않고 프라이밍 포트에 넣으세요.
준비된 DNA 라이브러리를 혼합한 후, 라이브러리 75마이크로리터를 시퀀싱 플로우 셀 샘플 포트에 드롭 방식으로 적재합니다. 플로우셀 샘플 포트 캡을 닫아 벙그가 샘플 포트에 안전하게 들어오도록 한 후, 프라이밍 포트를 단단히 닫습니다. 젤 전기영동은 거의 모든 샘플에서 앰플리콘 무결성을 확인했으나, 샘플 89와 136에 해당하는 레인에서는 희미하거나 없는 밴드가 나타났습니다.
샘플 89와 136은 증폭자 농도가 부족하여 장기 독부 시퀀싱에서 제외되었습니다. 모든 표적 유전자에 걸쳐 롱리드와 단리드 플랫폼은 높은 커버리지 깊이를 달성했으며, EIS 유전자는 가장 높은 평균 값을, RRS 유전자는 가장 낮은 커버리지 깊이를 보였습니다. 커버리지 깊이의 범위가 넓음에도 불구하고, 두 플랫폼 모두 모든 내성 관련 유전자에서 99.9%의 높은 커버리지 폭을 유지했습니다.
에탐부톨, 플루오로퀴놀론, 카나마이신, 아미카신, 카프레오마이신에 대한 약물 내성 변이가 단독 및 장기 시퀀싱 플랫폼에서 100% 일치로 검출되었습니다. 리네졸리드, 베다퀼린, 클로파지민 중 어느 시퀀싱 방식에서도 내성 관련 돌연변이는 발견되지 않았습니다. 스트렙토마이신 내성 검출은 플랫폼 간 일치도가 낮아 71.43%에 불과했습니다.
주요 유전자 rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA, pncA의 탐지 민감도는 플랫폼 간 89.47%에서 96.77% 사이였다.
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개요
이 연구는 자원이 제한된 환경에서 약제 내성 결핵(TB) 감수성을 결정하기 위한 휴대용 장염 시퀀싱의 사용을 조사합니다. 이 프로토콜은 금 표준 방법과 비교할 수 있는 정확한 결과를 제공하고, TB 진단을 강화하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 미생물학
- 유전체학
- 전염병
배경
- 약제 내성 결핵은 중요한 글로벌 건강 문제입니다.
- 전통적인 진단 방법은 자원이 부족한 환경에서 제한될 수 있습니다.
- 장염 시퀀싱은 정확성과 반환 시간에서 잠재적인 이점을 제공합니다.
- 생물정보학 전문 지식은 효과적인 진단의 장벽이 되는 경우가 많습니다.
연구 목적
- TB 진단을 위한 장염 시퀀싱의 효과를 평가합니다.
- 임상 샘플로부터 종합적인 내성 프로파일을 제공합니다.
- 약제 내성 검출을 위한 워크플로를 단순화합니다.
사용된 방법
- 18개 약제 내성 영역의 표적 차세대 시퀀싱.
- 결핵 특이적 생물정보학 파이프라인의 활용.
- 정밀한 앰플리콘 측정을 포함하는 샘플 준비.
- 최적의 시퀀싱 결과를 위한 샘플 부피 조정.
주요 결과
- 장염 시퀀싱은 금 표준과 비교 가능한 정확성을 보였습니다.
- 전통적인 방법에 비해 더 빠른 반환 시간이 달성되었습니다.
- 이 프로토콜은 종합적인 TB 진단을 가능하게 했습니다.
- 자원이 제한된 환경에서 강화된 발병 추적이 가능했습니다.
결론
- 휴대용 장염 시퀀싱은 저자원 환경에서 TB 진단을 개선할 수 있습니다.
- 이 방법은 광범위한 생물정보학 전문 지식의 필요성을 줄입니다.
- 이 접근 방식은 TB 관리 및 통제 전략을 변화시킬 잠재력이 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Portable long-read amplicon sequencing enables rapid, comprehensive detection of drug resistance mutations in tuberculosis directly from clinical samples, addressing critical diagnostic gaps in resource-limited settings. This approach supports predictive confidence in resistance profiling and accelerates actionable insights for infectious disease portfolio management. Its deployment can de-risk early diagnostic decisions and expand access to high-quality molecular testing across diverse geographies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of resistance-associated genetic variants in clinical isolates.
- Supports functional validation of resistance mechanisms for target prioritization.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming variant-drug associations.
- Improves predictive confidence in resistance marker selection for diagnostic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated amplicon panels for high-throughput resistance screening workflows.
- Delivers quantitative variant frequency data to inform assay sensitivity thresholds.
- Supports reproducible detection of high-frequency resistance mutations across platforms.
- Enables scalable deployment of portable sequencing for decentralized testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns resistance variant detection with translational biomarker strategies for infectious disease programs.
- Ensures continuity from discovery of resistance markers to preclinical validation of diagnostic assays.
- Provides risk-adjusted data for advancing diagnostic candidates targeting drug-resistant TB.
- Supports outbreak tracking and surveillance in translational research settings.
Pipeline & Workflow Integration
This sequencing protocol bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling rapid, field-deployable resistance profiling and supporting data-driven advancement of diagnostic assets.
- Discovery Biology: Confirms resistance mechanisms and variant-drug relationships in clinical samples.
- Screening: Provides quantitative, reproducible variant detection for assay optimization.
- Analytics: Generates high-coverage, cross-platform concordant data for resistance-associated genes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and outbreak surveillance in preclinical pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable sequencing capability adaptable to multiple infectious disease targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance profiling and target validation.
- Operational Value: Reduces infrastructure requirements and enables rapid, decentralized testing.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic development and deployment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for drug-resistant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in amplicon preparation and sequencing workflow execution.
- Needs access to portable long-read sequencing instrumentation and bioinformatics pipelines.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for variable sample quality and amplicon yield.
- Detection of low-frequency variants may be limited compared to high-accuracy short-read platforms.
