Name: Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 광학 투명화와 면역표지를 결합한 전체 마운트 공초점 현미경법으로 망막 오가노이드의 3D 구조를 세포 수준에서 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 망막 질환 연구와 재생의학 발전에 중요한 통찰을 제공합니다.

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1. 맞춤형 형광 2차 항체의 제조
참고: 이 접근법은 상용 형광 항체 사용에 대한 대안으로 사용됩니다(형광 2차 항체 준비의 이점에 대한 논의 참조). 또한, 이 프로토콜은 직접 면역형광을 수행해야 하고 형광 1차 항체가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우 형광단을 1차 항체에 접합하는 데 사용할 수 있습니다. 라벨링 반응에서 형광단의 양을 조정하여 형광단 대 항체 비율을 제어하면 더 밝은 접합 항체가 생성됩니다. 그러나 맞춤형 2차 항체는 안정성이 떨어지고 생성된 접합체의 농도는 상용 형광 항체의 농도보다 10배 낮습니다. 이 프로토콜은 Bálint et al9에 의해 설명된 연구에서 채택되었습니다.
<ol>
	<li>1mg의 형광단을 무수 DMSO에 용해시키고 튜브당 최종 0.02mg의 형광단을 위해 튜브에 분취합니다. 1시간 30분 동안 작동하는 속도 진공 농축기를 사용하여 모든 DMSO를 제거합니다. 부분 표본은 -20ºC에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오. Alexa Fluor 405의 경우 초순수 H2O가 부분 표본 제조에 적합한 용매입니다.</li>
	<li>라벨링 반응을 수행하기 위해 형광단 분취액 1개를 1-10μL의 DMSO(또는 Alexa Fluor 405의 경우 초순수 H2O)에 용해시킵니다. 참고: DMSO의 정확한 양은 이전 대조군 접합 테스트를 통해 결정되었습니다. 이러한 검사는 형광단의 새로운 배치를 사용해야 하는 경우(또는 이전 형광단 배치가 소진된 경우) 또는 접합에서 새로운 형광단을 처음 사용할 때 수행됩니다. control conjugation test는 conjugate에서 최적의 fluorophore-to-antibody ratio를 결정하기 위해 다양한 양의 fluorophore로 라벨링 반응을 수행하는 것을 포함합니다. 우리의 경우 최적 비율은 일반적으로 3μL에서 5μL 사이입니다.</li>
	<li>빛으로부터 보호되는 흔들 플랫폼에서 실온(RT)에서 50μL의 2차 IgG(또는 1차), 6μL의 1M NaHCO3 및 1-5μL의 형광단을 40분 동안 배양합니다.</li>
	<li>반응이 진행되는 동안 뚜껑을 제거하고 완충액이 통과하도록 하여 정제 크기 배제 컬럼을 준비합니다. 컬럼을 통해 3 x 2-3mL의 PBS를 실행하여 컬럼(각 라벨링 반응에 대해 하나씩)을 평형화합니다. 배양이 끝나기 전에 마지막 평형 단계가 완료된 경우, 뚜껑이 마르지 않도록 뚜껑을 다시 끼우고 라벨링 반응이 끝날 때까지 기다립니다. 참고: 정화 크기 제외 컬럼은 중력에 의해 작동합니다. 컬럼이 어느 순간에도 마르지 않는지 확인하십시오., 또는 정제 반응이 제대로 작동하지 않을 것입니다.</li>
	<li>반응이 완료되면(단계 1.3) 라벨링 반응에 PBS 140μL를 추가하여 부피를 약 200μL로 만들고 와류로 만듭니다. 이 용액을 컬럼 중앙에 추가하고, 샘플이 컬럼에 들어가도록 한 다음, 마지막 한 방울이 용리된 후 550μL의 PBS를 첨가하여 밀어 넣습니다. 액체가 더 이상 떨어지지 않으면 PBS 300μL를 첨가하여 용리하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>280nm에서 샘플의 흡광도와 사용된 형광단의 흡광도를 측정하여 항체 농도 및 표지 비율을 계산합니다. Beer-Lambert 법칙을 적용하여 다음과 같이 농도(몰 농도)를 측정합니다. 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> 여기서 A는 흡광도, ε는 몰 흡광 계수, CF280 은 280nm에서 특정 형광단이 갖는 흡광도를 측정 한 것으로, 이는 보정 계수로 작용합니다. 그러면 항체의 농도는 다음과 같습니다. 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> 그리고 라벨링 비율은 다음과 같습니다. 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>표지된 항체를 빛으로부터 보호되는 4ºC에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.</li>
</ol>
2. 면역형광 라벨링
<ol>
	<li>4% 파라포름알데히드(PFA)로 오가노이드를 실온에서 45분 동안 고정합니다. 참고: 선택 사항: 항원의 면역 활성을 향상시키기 위해 항원 회수 용액(2.2 및 2.3단계)으로 오가노이드를 배양합니다.</li>
	<li>초순수 H2O에 0.117 mg의 구연산나트륨 삼염기성 이수화물을 혼합하여 40 mL의 항원 회수 용액을 준비하고 pH 9로 조정합니다.</li>
	<li>항원 회수 용액으로 오가노이드를 60°C에서 1시간 동안 약한 흔들림(30rpm)으로 배양합니다.</li>
	<li>PBST(1% Triton X-100이 함유된 PBS)로 오가노이드를 투과화하고 RT에서 4시간 동안 가벼운 진탕을 가합니다.</li>
	<li>오가노이드를 차단 용액(0.1% Triton X-100이 함유된 2% 소 혈청 알부민(BSA))으로 RT에서 하룻밤(또는 1일 이상) 차단합니다. 참고: 1차 및 2차 항체 농도는 특정 항체에 따라 다릅니다. 전체 마운트 샘플의 면역 형광을 위해 당사는 단면 샘플과 비교하여 더 높은 농도를 사용합니다. 당사는 10μg/mL로 1차 항체를 배양하며, 이는 대부분의 경우 재고의 1:100에 해당합니다(표 1). 당사는 맞춤형 2차 항체를 20-50 μg/mL로 배양합니다.</li>
	<li>세척액(0.1% BSA와 0.1% Triton X-100)에 희석한 1차 항체를 4°C에서 2일 동안 가벼운 쉐이킹으로 오가노이드를 배양합니다.</li>
	<li>오가노이드를 세척액으로 3 x 15분 동안 세척하고 RT에서 가볍게 흔듭니다.</li>
	<li>세척액에 희석한 2차 항체를 4°C에서 2일 동안 가볍게 흔들어 오가노이드를 배양합니다.</li>
	<li>오가노이드를 세척액으로 3 x 15분 동안 세척하고 RT에서 가볍게 흔듭니다. 참고: 면역 표지 후 선택한 형광 염료를 배양할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 액틴 필라멘트 네트워크를 시각화하기 위해 DAPI(1:1,000) 및 DRAQ5(1:500) 또는 팔로이딘(1:100)과 같은 형광 핵 마커를 사용합니다.</li>
	<li>세척액에 희석한 형광 염료를 RT에서 1시간 동안 가볍게 흔들어 오가노이드를 배양합니다.</li>
	<li>오가노이드를 세척액으로 3 x 15분 동안 세척하고 RT에서 가볍게 흔듭니다.</li>
</ol>
3. FluoClear BABB를 사용한 광학 클리어링
참고: 1-프로판올은 특히 장기간 노출될 경우 플라스틱 용기를 손상시킬 수 있습니다. 안전을 위해 유리 용기를 사용하십시오.
<ol>
	<li>탈수 단계<ol>
		<li>주어진 백분율 (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %)에서 초순수 H2O에 1- 프로판올 용액을 준비 한 다음 트리메틸 아민으로 pH 9.5로 조정하십시오. 주의: 트리에틸아민은 흡입하면 독성이 있습니다. 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 용액은 적절하게 보관하면 재사용할 수 있습니다(잘 밀봉된 용기). 사용하기 전에 pH를 조정하십시오.</li>
		<li>1-프로판올 용액(15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%)의 기울기가 증가하면서 30°C에서 각각 2시간 동안 가벼운 진탕으로 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>100% 1-프로판올로 샘플을 30°C에서 가벼운 쉐이킹과 함께 밤새 배양합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>청산 단계 주의 : BABB는 많은 플라스틱을 용해시키거나 크게 손상시키는 능력으로 알려진 강력한 용매 혼합물입니다. 안전을 위해 호환되는 뚜껑이 있는 유리 용기를 사용하고 흄 후드 내부에서 작업하십시오.<ol>
		<li>벤질 알코올(BA)과 벤질 벤조에이트(BB)를 1:2 비율로 혼합하여 BABB를 준비합니다.</li>
		<li>RT에서 BABB에 시료를 하룻밤 동안 담급니다.</li>
		<li>이미징하기 전에 BABB를 새로 고칩니다. 참고: ~1mm 직경의 오가노이드의 경우, BABB는 수십 분 안에 뚜렷한 세clearing 효과를 유도합니다. 샘플의 크기와 특성에 따라 투명화 정도가 다를 수 있으며 투명화 용액에 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있습니다. 클리어링 프로토콜을 개선하기 위해 BABB 침지 전후에 이미지를 획득하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>BABB 투명화된 시료를 BABB 용액으로 4°C에서 장기간 보관합니다. 형광을 보존하기 위해 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 전체 마운트 이미지 획득
<ol>
	<li>유리 피펫을 사용하여 오가노이드를 BABB 한 방울과 함께 유리 바닥의 페트리 접시에 놓습니다. 샘플이 커버 글라스 표면과 접촉하는지 확인하십시오. 주의 : s가 들어 있는 BABB 한 방울이ample의 플라스틱 가장자리에 닿지 않거나 플라스틱이 녹아 샘플과 이미징의 품질이 손상됩니다.</li>
	<li>저배율 및 고배율 대물렌즈가 장착된 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 Z 스택 이미지를 획득하여 세포 세부 정보가 포함된 샘플의 완전한 3D 통찰력을 얻을 수 있습니다. 참고: 이 연구를 위해 각각 3.5μm 및 1μm의 단계 크기를 가진 10x NA(NA) 0.4 공기 대물렌즈와 63x NA 1.4 대물렌즈가 사용되었습니다.</li>
</ol>
5. 이미지 처리
<ol>
	<li>투명화 용액과 침지 매체 사이의 굴절률(RI) 불일치를 고려하여 Z-stack 획득의 단계 크기를 재보정합니다.<ol>
		<li>다음과 같이 재보정된 스텝 크기를 계산합니다. 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> 3.5μm 스텝 크기의 공기 대물렌즈로 이미징한 BABB에 내장된 샘플의 경우 다음과 같습니다. 
		<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li>
		<li>ImageJ를 사용하여 복셀 깊이 를 변경합니다( 이미지 | 속성...) 다시 계산된 단계 크기의 경우.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z 스택의 이미지 프로젝션을 만듭니다.<ol>
		<li>ImageJ를 사용하여 Z-스택을 심층적으로 검사합니다( 이미지 클릭 | 스택 | 직교 뷰). 망막 오가노이드의 XY, XZ 및 YZ 보기가 나타납니다.</li>
		<li>원하는 관심 영역을 저장합니다(File(파일) | 다른 이름으로 저장...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>프로세싱 소프트웨어를 사용하여 Z 스택의 3D 렌더링 애니메이션을 만듭니다( 재료 표 참조).<ol>
		<li>확인란을 활성화하여 시각화할 채널을 선택합니다.</li>
		<li>Z-planes를 조정하여 샘플의 내부를 시각화합니다(확인란에서 Clipping 활성화).</li>
		<li>동영상 편집기를 사용하여 애니메이션을 녹화합니다(확인란에서 동영상 편집기 활성화). 드래그 앤 드롭하고 마우스를 사용하여 직접 확대 및 축소할 수 있습니다. 추가를 클릭하여 애니메이션에 다른 클립을 포함합니다. Z-평면을 조정하는 경우 Clip planes 옵션을 활성화합니다( Settings... | 평면 클립(Clip planes ) 상자 선택).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Darche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+cleared+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes.</a> Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x NA0.40 DRY 대물렌즈</td><td>라이카</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63x NA1.40 오일 대물렌즈</td><td>라이카</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>항-GFP 항체</td><td>아브캠</td><td>AB13970</td><td>-</td></tr><tr><td>벤질 알코올(BA)</td><td>시그마 알드리치</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>벤질 벤조에이트(BB)</td><td>시그마 알드리치</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>바닥 유리 페트리 접시</td><td>매텍</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마 알드리치</td><td>A7030</td><td>-</td></tr><tr><td>Chx10 항체</td><td>스타 크루즈 바이오텍</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Cytiva Illustra Nap-5 겔 여과 컬럼, Sephadex G-25</td><td>시그마 알드리치</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마 알드리치</td><td>디9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마 알드리치</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>드라큐5</td><td>써모피셔</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>염료(카르복실산, 숙신이미딜 에스테르)</td><td>Invitrogen 또는 Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/피지&nbsp;</td><td>NIH</td><td>&nbsp; v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>도립 공초점 레이저 스캐닝 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>LAS X 3D 처리 소프트웨어</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Synergy 정수 시스템의 초순수</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>아크로스 오가닉스</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>표지되지 않은 2차 IgG</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>옵신 블루 항체</td><td>밀리포어&nbsp; &nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>옵신 RG 항체</td><td>밀리포어</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA) 4%</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS 솔루션</td><td>깁코</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>팔로이딘 라벨링 프로브</td><td>써모피셔</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>깁코&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>RECOV 항체</td><td>밀리포어</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>RHO(RET-P1) 항체</td><td>시그마 알드리치</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>구연산나트륨 삼염기성 이수화물&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>TUJ1 항체</td><td>코밴스&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

whole-mount retinal organoid visualization with cellular resolution

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

여기서는 인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기법을 제시합니다.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

이 연구는 절제 처리 중 망막 무결성을 손상시키는 것을 방지하는 새로운 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모형을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이것은 과대 유리체와 근본적인 망막 안료 상피 코로이드 (RPE-choroid) 및 clera로 망막을 배양해서 달성됩니다.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

이 프로토콜은 투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 샘플에 대한 최적화되고 정교한 준비 절차를 제공합니다. 성숙한 망막 오가노이드의 시냅스 분석과 관련된 응용 분야에 적합합니다.

투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

미세아교세포는 망막에 존재하는 독특한 면역 세포로, 다양한 망막 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양 모델을 생성하면 망막 질환의 발병 기전 및 발병 진행 상황을 더 잘 이해할 수 있습니다.

미세아교세포(Microglia)를 이용한 망막 오가노이드 조립

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 광학 투명화와 면역표지를 결합한 전체 마운트 공초점 현미경법으로 망막 오가노이드의 3D 구조를 세포 수준에서 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 망막 질환 연구와 재생의학 발전에 중요한 통찰을 제공합니다.

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

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