Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

우리의 연구는 인간 망막이 어떻게 형성되는지, 질병이 어떻게 영향을 미치는지, 어떻게 치료할 수 있는지 연구하기 위해 인간 시험관 내 모델 역할을 하는 망막 오가노이드를 개발하고 연구하는 데 중점을 두고 있습니다.

재생 의학 분야의 연구를 발전시키기 위해 광학 투명화 및 면역 표지와 결합된 3D 망막 오가노이드를 사용하여 전체 구조를 시각화하고 공초점 현미경으로 망막 세포의 특수 조직을 연구합니다.

전체 마운트 이미징은 조밀한 조직에서 고르지 않은 항체 침투 및 오가노이드의 구면 수차와 같은 문제에 직면해 있으며, 이로 인해 조직 시각화 중에 표면 편향 표지 및 초점 손실이 발생합니다.

우리의 방법은 3D 구성 하에서 망막 세포 연결, 세포 유형을 밝혀 망막 질환의 근본 원인에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

[강사] 시작하려면 무수 DMSO에 용해된 형광단 분취량을 탈수 및 냉동합니다. 분취량에 1-10마이크로리터의 DMSO를 첨가하십시오. 이제 2차 면역글로불린 G 또는 1차 항체 50마이크로리터, 1몰 중탄산나트륨 6마이크로리터, 형광단 1-5마이크로리터를 결합하고 빛으로부터 보호된 실온에서 40분 동안 흔들리는 플랫폼에서 배양합니다. 반응이 진행되는 동안 정제 크기 배제 컬럼의 뚜껑을 제거하고 완충액이 통과하도록 합니다. 컬럼을 통해 2-3밀리리터의 PBS를 3회 실행하여 컬럼을 평형화합니다. 배양이 끝나기 전에 마지막 평형이 끝나면 뚜껑이 당기지 않도록 뚜껑을 다시 넣고 반응이 완료될 때까지 기다립니다. 배양 후, 표지 반응에 140마이크로리터의 PBS를 첨가하여 부피를 약 200마이크로리터로 만들고 소용돌이치게 합니다. 용액을 컬럼 중앙에 추가하고 컬럼에 들어가도록 합니다. 마지막 한 방울이 빠진 후 550마이크로리터의 PBS로 용액을 밀어냅니다. 액체가 떨어지지 않으면 300마이크로리터의 PBS로 용리하고 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 모으십시오. 280나노미터 및 형광단 특이적 파장에서 샘플의 흡광도를 측정하여 항체 농도와 라벨링 비율을 계산합니다. 표지된 항체는 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 망막 오가노이드를 4% 파라포름 알데히드로 실온에서 45분 동안 고정합니다. 고정 후 오가노이드 위에 항원 회수 용액을 첨가하고 접시를 섭씨 60도에서 분당 30회전으로 1시간 동안 약하게 흔들면서 배양합니다. 다음으로, 1% Triton X-100을 함유하는 PBS로 오가노이드를 투과화합니다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 가볍게 흔들면서 배양합니다. 이제 실온에서 밤새 또는 하루 이상 0.1% Triton X-100으로 2% BSA의 오가노이드를 차단합니다. 다음날, 희석된 1차 항체를 오가노이드에 첨가합니다. 섭씨 4도에서 이틀 동안 살짝 흔들면서 배양합니다. 오가노이드를 실온에서 세척액으로 각각 15분 동안 3회 세척하고 가볍게 흔듭니다. 이제 희석액 2차 항체를 첨가하고 섭씨 4도에서 살짝 흔들면서 2일 동안 배양합니다. 앞서 시연한 바와 같이 오가노이드를 세척한 후, 실온에서 세척액에 희석한 형광 염료와 함께 오가노이드를 1시간 동안 살짝 흔들면서 배양합니다. 그런 다음 다시 씻으십시오. 다음으로, 15%, 30%, 45%, 60%, 75% 및 90% 농도의 초순수에 1-프로판올 용액을 제조하고 트리메틸아민으로 각각 pH 9.5로 조정합니다. 1-프로판올 용액의 증가하는 구배로 각각 섭씨 30도에서 2시간 동안 경미를 가볍게 흔들면서 샘플을 순차적으로 탈수합니다. 그런 다음 샘플을 100% 1-프로판올 용액으로 옮기고 섭씨 30도에서 살짝 흔들면서 밤새 배양합니다. 시료 제거를 위해 벤질 알코올과 벤질 벤조에이트 혼합물을 1:2 비율로 준비하여 BABB 용액을 만듭니다. 샘플을 실온에서 밤새 BABB에 담그십시오. 이미징하기 전에 BABB 솔루션을 새로 고칩니다. 유리 피펫을 사용하여 BABB 한 방울이 있는 유리 바닥 페트리 접시에 오가노이드를 배치하여 커버 유리 표면에 닿도록 합니다. 이제 저배율 및 고배율 대물렌즈가 있는 도립 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 3D 셀룰러 해상도를 위한 Z-스택 이미지를 획득합니다. 투명 용액과 침지 매체 간의 굴절률 불일치를 고려하여 Z-스택 획득의 단계 크기를 재보정합니다. 이제 ImageJ를 실행하고 이미지를 선택하고 속성을 클릭하여 복셀 깊이를 업데이트하여 Z-스택의 이미지 프로젝션을 만듭니다. 이미지, 스택을 선택한 다음 Orthogonal Views를 선택하여 망막 오가노이드의 XY, XZ 및 YZ 뷰를 표시하여 Z-스택 깊이를 검사합니다. 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택하여 원하는 영역을 저장합니다. 마지막으로 처리 소프트웨어를 사용하여 Z-스택의 3D 렌더링 애니메이션을 만듭니다. 과당 글리세롤 제거 망막 오가노이드는 투명도의 개선이 가장 적어 오가노이드 코어의 시각화를 방해했습니다. ECI 클리어링은 망막층의 시각화를 개선했지만 지속적인 광산란으로 인해 여전히 오가노이드 코어를 드러내지 못했습니다. Fluoclear BABB 투명 오가노이드는 가장 높은 투명성을 나타냈으며, 일관된 형광으로 피질과 코어를 모두 명확하게 드러냈습니다. ECI 및 fluoclear BABB 투명 오가노이드 모두 탈수 단계로 인해 명시야 이미지에서 눈에 띄는 수축을 나타냈습니다. BABB 유도 수축은 샘플 컴팩트함을 증가시켜 고배율 대물렌즈를 사용하여 더 깊은 구조를 이미지화할 수 있게 했습니다. 시험관 내 40일째 TUJ1 면역 표지는 눈에 보이는 층화 없이 하나의 얇은 신경 층을 나타냈습니다. 90일까지 세포는 정점 영역을 조밀하게 채웠고, 170일에는 오가노이드가 정의된 정점 영역을 가진 층상 조직의 명확한 징후를 보였습니다. 200일째, 길쭉한 세포 돌출부가 표면에서 코어로 안쪽으로 확장되었고, 오가노이드는 250일에 3개의 뚜렷한 망막층으로 발달했습니다. 신경 섬유는 성숙을 통해 오가노이드 중심에서 주변부로 확장되어 시험관 내에서 250일까지 더 두껍고 복잡해졌습니다. 파란색 및 녹색/빨간색 옵신을 발현하는 원뿔형 광수용체는 후기 단계에서 나타났으며 밝은 끝을 가진 길쭉한 형태를 보였습니다. 로돕신을 발현하는 막대 광수용체는 중심핵과 말초 옵신 분포에 의해 확인되었습니다. Chx10 양성 세포는 처음에는 널리 분포했지만 나중에 오가노이드 성숙 동안 내부 핵층에 특이적으로 국한되었습니다. 내인성 GCaMP6s 발현은 BABB 제거 후 보존되었으며, 장기 고정 후 신경망막에서 GFP 신호가 검출될 수 있었습니다.