마우스 배럴 피질의 일주기 시냅스 가소성 분석을 위한 시각화 기술로서의 투과 전자 현미경

우리는 신경 가소성, 특히 시냅스, 뉴런 및 신경교 세포의 가소성의 일주기 변화에 관심이 있습니다. 우리는 시냅스가 낮과 밤, 병리학적 조건에서 어떻게 변형되는지에 대한 질문에 답하려고 노력하고 있습니다. 우리 연구 분야의 가장 최근 발전은 다양한 유전 도구를 사용하여 유전자 발현을 조작하고 뇌의 변화를 시각화하는 방법을 사용하는 것이며 신경퇴행성 질환을 연구하기 위한 동물 모델의 수가 증가하고 있습니다. 우리는 전자 투과 현미경을 사용하여 마우스의 배럴 피질에 있는 시냅스의 수가 낮과 밤에 변한다는 것을 발견했습니다. 그리고 이 리듬은 적어도 억제성 시냅스의 경우 일주기이기도 합니다. 억제성 시냅스이기 때문에 밤에는 그 수가 증가하고 흥분성 시냅스는 낮에 증가합니다. 초파리의 뇌에서도 비슷한 변화를 발견했습니다. 이 종에서는 시냅스의 수도 낮과 밤에 변합니다. 또한 뉴런과 신경교세포의 형태에 구조적 변화가 있음을 발견했습니다.

[해설자] 시작하려면 쥐의 소뇌를 가져와 뇌를 두 개의 반구로 나눕니다. 하나의 반구를 선택하고 섹션이 배럴 피질에 접선 방향으로 절단될 수 있도록 방향을 지정합니다. 그런 다음 절편을 60마이크로미터 두께로 절단하고 0.1몰 인산염 완충액과 고정액을 1:5 비율로 함유한 용액에 옮깁니다. 광학 현미경으로 절편을 검사하고 배럴 필드 피질을 명확하게 보여주는 절편만 수집합니다. 붓을 사용하여 섹션을 작은 유리 페트리 접시에 부드럽게 옮깁니다. 뇌 절편을 0.1몰 카코딜레이트로 헹굽니다. 그런 다음 1.5% 페리시안화칼륨이 포함된 0.1몰 카코딜레이트 완충액에 1% 사산화오스뮴에 절편을 고정합니다. 절편을 증류수로 헹구면 25mm 필터가 있는 주사기를 사용하여 1% 우라닐 아세테이트를 함유한 70% 에탄올을 조직이 있는 각 페트리 접시에 천천히 분배합니다. 섭씨 4도에서 70% 에탄올에서 하룻밤 배양한 후 80%, 90% 및 100% 에탄올로 조직을 세척합니다. 그런 다음 프로필렌 옥사이드로 각각 10분 동안 조직을 두 번 세척합니다. 다음으로, 프로필렌 옥사이드를 폴리/베드 수지와 프로필렌 옥사이드의 일대일 혼합물 2밀리리터로 교체합니다. 뚜껑을 덮고 40분 동안 배양합니다. Poly/Bed 수지와 프로필렌 옥사이드의 3:1 혼합물 2밀리리터에 뇌 절편을 삽입합니다. 뚜껑을 덮고 1.5시간 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 ACLAR 필름을 표준 유리 슬라이드 크기와 일치하는 조각으로 자릅니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 각 ACLAR 필름 조각에 소량의 수지를 도포합니다. 붓을 사용하여 페트리 접시의 뇌 섹션을 ACLAR 필름의 수지로 옮깁니다. 두 개의 ACLAR 필름 사이에 각 섹션을 매립하고 배양하여 중합합니다. 2배 대물렌즈가 있는 광학 현미경을 사용하여 내장된 뇌 절편을 촬영합니다. 이미지를 열려면 파일 및 열기를 클릭하고 Shift 키를 누른 상태에서 이미지를 선택한 다음 열기를 클릭합니다. 피질에서 이미지 쌓기를 시작합니다. 각 이미지에서 레이어 1을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 레이어 복제를 선택한 다음 대화 상자에 이미지 번호를 이름으로 입력합니다. 하나의 이미지를 대상 파일로 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 이동 도구를 사용하여 이미지를 수동으로 정렬하고 필요에 따라 편집, 변형, 회전 또는 대칭 이동을 사용하여 방향을 조정합니다. 더 세밀하게 조정하려면 편집, 변형, 왜곡을 사용하고 모서리를 개별적으로 이동하여 해부학적 랜드마크와 일치시킵니다. 정렬을 용이하게 하기 위해 레이어 패널에서 맨 위 레이어의 혼합 모드를 오버레이로 설정합니다. 배럴 피질을 표시하는 각 섹션에서 실체 현미경을 사용하여 선택한 배럴을 식별하고 면도날을 사용하여 인접한 배럴과 함께 잘라냅니다. 단면을 레진 블록에 내장한 후 초박형 단면을 Formvar 코팅된 단일 슬롯 니켈 그리드에 수집합니다. 앞에서 설명한 대로 TEM 이미지 스택을 정렬한 후 분석 영역을 정의합니다. 레이어를 클릭한 다음 새로 만들기 및 레이어를 클릭한 다음 확인을 클릭합니다. 사각형 도구를 선택하고 레이어, 레이어 스타일, 획으로 이동합니다. 획 색상, 두께 및 위치를 안쪽으로 설정한 다음 확인을 클릭합니다. 이제 직사각형을 그려 해석 경계를 정의하고 0% 채우기를 선택합니다. 주석에 대한 새 레이어를 추가하려면 레이어, 새로 만들기, 레이어를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 브러시 도구를 사용하여 이 레이어의 시냅스를 표시합니다. 확대/축소 도구와 손 도구를 사용하여 주석을 추가하는 동안 정밀도를 보장합니다. 이제 3D 재구성을 위한 이미지 스택을 엽니다. 자르기 도구를 선택하고 스택 전체에 수지상 척추가 포함된 영역을 표시한 다음 Enter 키를 눌러 표시되는 모든 레이어에서 해당 영역을 자릅니다. 한 번에 하나의 레이어만 표시하려면 레이어 패널에서 눈 아이콘을 전환합니다. 파일, 다른 이름으로 저장을 클릭하고 파일 이름을 지정하고 JPG 형식을 선택한 다음 확인을 클릭하여 자른 각 이미지를 별도로 저장합니다. 3D 재구성 소프트웨어를 엽니다. 업로드하기 전에 탐색 기즈모에서 Z를 클릭하거나 숫자 패드 7을 눌러 뷰포트 원근을 정렬합니다. 그런 다음 이미지를 업로드하려면 추가, 이미지, 참조를 클릭한 다음 첫 번째 이미지를 선택하고 두 번 클릭하여 확인합니다. z축을 따라 최종 TEM 이미지를 배치하려면 이미지를 클릭합니다. 오른쪽 사이드바의 개체 속성 패널에서 위치 Z 필드에 적절한 값을 입력합니다. 모든 이미지를 z축을 따라 고르게 분배하려면 모든 이미지 오브젝트를 선택합니다. 끝을 눌러 끝 패널을 엽니다. 편집 탭으로 이동하고 Z 분배를 클릭하여 단면 두께에 따라 자동으로 간격을 둡니다. 이미지당 단일 곡선을 사용하여 각 TEM 이미지에서 수지상 척추 모양의 윤곽을 수동으로 그리려면 추가, 곡선 및 원을 클릭합니다. 원을 이동하려면 g를 누른 상태에서 마우스를 드래그한 다음 클릭하여 배치를 확인합니다. s를 길게 눌러 크기를 조정한 다음 클릭하여 확인합니다. 그런 다음 수지상 척추의 모양에 맞게 물체의 크기를 조정합니다. 이제 척추 경계에 맞게 곡선 모양을 수정합니다. 제어점을 선택하고 g를 누르고 점을 이동한 다음 클릭하여 확인합니다. 필요에 따라 g 또는 s 키를 사용하여 핸들 포인트를 조정하고 곡선의 방향과 강도를 미세 조정합니다. 세부 정보를 추가하려면 Shift 키를 누른 상태에서 두 개의 인접한 제어점을 선택합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 세분화를 선택하여 그 사이에 새 점을 삽입합니다. 곡선이 척추의 윤곽을 정확하게 그려내면 레이아웃 탭으로 들어가 베지어 원 오브젝트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 마우스를 움직이지 않고 오브젝트 복제를 선택합니다. 결합된 객체의 가장자리를 연결하고 닫힌 메쉬를 형성하려면 모델링 탭으로 들어갑니다. 2를 눌러 Edge Select Mode로 전환합니다. 선택, 모두를 클릭하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 브리지 모서리 루프를 선택하여 모서리 링을 함께 연결합니다. 객체 상단의 간격을 채우려면 옆에 있는 을 클릭하여 모두 선택 취소합니다. Alt 키를 누른 채 상단 선반의 한쪽 가장자리를 클릭하여 전체 루프를 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 가장자리 돌출을 선택하고 z축을 따라 위쪽으로 끕니다. 이제 s를 누르고 마우스를 안쪽으로 움직여 새 루프를 축소한 다음 클릭하여 확인합니다. 루프를 선택한 상태에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 가장자리에서 새 면을 선택합니다. 최종 구조를 매끄럽게 하려면 오른쪽 사이드바의 수정자 탭으로 이동합니다. 수정자 추가(Add Modifier) 를 클릭하고 생성(Generate) 으로 이동한 다음 세분화 표면(Subdivision Surface) 을 선택합니다. 일관된 스무딩을 위해 뷰포트와 렌더 레벨을 1로 설정합니다. 개별 구조물에 색상을 지정하려면 원하는 객체를 선택합니다. 오른쪽 사이드바에서 재료 탭을 열고 새로 만들기를 클릭한 다음 기본 색상을 설정합니다. 조명 오브젝트를 선택하여 장면 조명을 조정합니다. g를 누른 상태에서 마우스를 움직여 조명의 위치를 변경한 다음 클릭하여 새 위치를 확인합니다. 렌더링을 위해 카메라를 배치하려면 최종 출력에 나타나야 하는 수지상 척추를 향하도록 뷰포트의 방향을 지정합니다. Control + Alt + 숫자 키패드 0을 눌러 카메라를 현재 보기에 스냅합니다. 카메라 프레임을 선택하고 g를 누른 상태에서 움직여 프레임을 다듬어 조정합니다. 마우스 체감각 피질은 염색되지 않은 뇌 절편에서도 식별할 수 있었고, 개별 배럴이 여러 섹션에 분포되어 있음에도 불구하고 디지털 도구를 사용하여 전체 배럴 필드를 재구성할 수 있었습니다. 연속적인 초박형 TEM 이미지를 통해 일련의 시각적 증거를 기반으로 시냅스를 흥분성 또는 억제성 유형으로 안정적으로 분류할 수 있었습니다. 연속 단편에서 수지상 가시를 3차원 재구성하면 척추 형태를 시각화할 수 있어 얇은, 버섯, 뭉툭한 가시, 중간 등 다양한 모양이 드러났습니다. 척추 모양은 척추 길이, 목 길이, 척추, 머리, 목의 직경을 포함한 측정을 기반으로 정량화되었습니다.