In Vitro 바이러스 수명 주기를 조사하기 위한 입자 시스템과 같은 SARS-CoV-2 바이러스 생산

우리는 실제 바이러스를 밀접하게 모방한 SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자를 생성하기 위해 최적화된 체외 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 생물 안전성 레벨 3 실험실이 필요한 제약 없이 바이러스 감염, 조립 및 배출 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

우리의 연구는 SARS-CoV-2 바이러스의 생물학을 이해하는 데 중점을 두고 있으며 특히 SARS-CoV-2에 대한 한의학에서 약물을 찾으려고 노력합니다. 모든 살아있는 SARS-CoV-2 바이러스 연구는 생물안전성 수준 3 실험실에서 통제되어야 합니다. 그리고 이러한 실험적 한계로 인해 SARS-CoV-2 연구는 소수의 삶에서만 실현 가능합니다. SARS-CoV-2 바이러스와 같은 SARS-CoV-2 연구의 실용적인 방법은 생물안전 레벨 3 실험실의 제한 없이 가능하며, 목록은 매우 유용한 방법이 될 것입니다.

[강사] 시작하려면 직경 10cm의 조직 배양 플레이트에 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 완전 배지가 있는 조직 배양 플레이트에 약 300만 개의 HEK-293T 세포를 시딩합니다. 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 약 24시간 동안 배양합니다. 현미경으로 세포 유창성을 확인하십시오. 무혈청 배지로 밀리리터당 1밀리그램의 PEI 용액에서 60마이크로리터의 PEI를 희석하여 최종 부피 200마이크로리터에 도달합니다. 이제 무혈청 배지 200마이크로리터를 취하여 N 플라스미드 6.7마이크로그램, Luc-T20 플라스미드 10마이크로그램, S 플라스미드 0.016마이크로그램, M-IRES-E 플라스미드 3.3마이크로그램을 첨가합니다. 희석된 PEI 용액을 바이러스 구조 단백질용 플라스미드 코팅이 포함된 용액에 부드럽게 첨가하고 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이것이 형질감염 용액입니다. 형질감염 용액을 HEK-293T 세포에 조심스럽게 떨어뜨리고 조직 배양 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 완전히 혼합되도록 합니다. 감염 후 6시간 후에 세포 배양 배지를 DMEM 완전 배지로 교환하고, 형질감염된 HEK-293T 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 48시간 동안 배양합니다. SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자를 포함하는 감염된 HEK-293T 세포의 상청액을 수집합니다. 수집된 상청액을 0.45마이크로미터 주사기 필터로 여과하여 세포 파편을 제거합니다. SC2-VLP 매체입니다. 안지오텐신 전환 효소 2 또는 ACE TMPRSS2 2의 안정적인 발현을 가진 40,000개의 HEK-293T 세포를 96웰 플레이트에 시드하고 50마이크로리터의 SC2-VLP 배지를 추가합니다. 96웰 조직 배양 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 24시간 동안 배양합니다. 배양 후, 96웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거하고 섭씨 37도로 예열된 100마이크로리터의 PBS로 한 번 세척합니다. ACE2 TMPRSS2 세포로 파종된 HEK-293T 세포를 20마이크로리터의 수동 용해 완충액으로 용해하고 실온에서 15분 동안 궤도 셰이커에서 샘플을 부드럽게 흔듭니다. 냉장 마이크로플레이트 원심분리기를 사용하여 섭씨 4도에서 15분 동안 96웰 플레이트를 섭씨 4,000G에서 회전시킨 다음 즉시 플레이트를 얼음 수조로 옮깁니다. 재구성된 루시페라제 분석 완충액 100마이크로리터를 새로운 불투명 흰색 96웰 플레이트에 넣고 각 웰에 20마이크로리터의 용해물을 첨가합니다. 위아래로 2-3회 피펫팅하여 잠시 혼합합니다. 플레이트 리더를 사용하여 발광 신호를 측정합니다. 다음으로, SC2-VLP 배지의 조성을 평가하기 위해 1.36밀리리터의 PEG 8000 용액을 10밀리리터의 SC2-VLP 배지에 첨가합니다. 혼합물을 궤도 셰이커에 놓고 밤새 섭씨 4도에서 천천히 섞습니다. 용액을 섭씨 4도 및 2,000G에서 30분 동안 원심분리합니다. 그리고 웨스턴 블로팅 분석을 위해 SC2-VLP 펠릿을 수집합니다. 직경 15mm의 유리 바닥 배양 접시에 약 300만 개의 HEK-293T 세포를 고르게 파종하고 세포가 약 70% 합류에 도달할 때까지 부착하고 성장하도록 합니다. 변형된 플라스미드 양으로 앞서 시연한 바와 같이 세포를 형질체한 후, 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 배양 접시를 부드럽게 두 번 세척합니다. 실온에서 4% 파라포름 알데히드 고정액 1밀리리터를 넣고 15분 동안 배양합니다. 실온에서 PBS 1밀리리터로 세포를 각각 5분 동안 2회 세척하고, 1밀리리터의 0.25% Triton X-100을 10분 동안 첨가하여 세포를 투과화합니다. 다시 실온에서 PBS 1밀리리터로 세포를 각각 5분 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 5% 소 혈청 알부민 1밀리리터를 1시간 동안 첨가하여 비특이적 항체 상호작용을 차단합니다. 약 200마이크로리터의 1차 항체 용액을 첨가하여 유리 바닥을 덮고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 1차 항체 용액을 제거하고 실온에서 PBS 1밀리리터로 세포를 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 이제 형광 접합 2차 항체 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 실온에서 5분 동안 Hoechst 용액 밀리리터당 2.5마이크로그램으로 핵을 염색합니다. 마지막으로, PBS로 세포를 세척한 후, 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득하기 전에 S 단백질 또는 소기관 염색을 관찰합니다. 이 그림은 스파이크 단백질을 암호화하는 플라스미드의 다양한 형질감염량에 대한 SC2-VLP 생산의 민감도를 보여줍니다. SC2-VLP 역가는 0.016마이크로그램의 S 플라스미드를 형질감염했을 때 가장 높았고 0.16 및 1.6마이크로그램의 S 플라스미드에서는 유의하게 감소했습니다. 스파이크 단백질의 H1271에서 E 돌연변이는 야생형에 비해 SC2-VLP 역가를 유의하게 감소시켰습니다. E1262에서 H로의 돌연변이는 SC2-VLP 역가의 적당한 감소로 이어진 반면, E1262에서 H로, H1271에서 E로의 이중 돌연변이는 생산을 완전히 폐지했습니다. 전장 S 및 S-2 단백질 밴드는 야생형에 비해 E1262에서 H 및 이중 돌연변이 레인으로 감소했습니다. S 패키징 효율도 E1262에서 H로, H1271에서 E로 변이체로 감소했으며 이중 돌연변이체에서는 거의 폐지되었습니다. VLP 풍부도는 야생형과 모든 S 돌연변이체에서 크게 변하지 않았습니다. 야생형 S 단백질은 cis-Golgi 마커 GM130과 공국소화되었지만 ER 마커 Sec61 베타 또는 ERGIC 마커 ERGIC 53과는 공국소화되지 않았습니다. H1271에서 E 돌연변이 S 단백질은 미만성 세포질 분포를 나타냈고 GM130과의 공국소화가 부족했습니다.