애기장대 로제트를 이용한 잎 표면 및 아포플라스틱 RNA의 분리 및 분석에 대한 단계별 가이드

우리는 식물이 마이크로바이옴을 조절하는 방법과 식물에서 분비되는 RNA가 식물을 식민지화하는 원핵 및 진핵 미생물 모두에서 유전자 발현을 조절하는지 여부를 이해하려고 노력하고 있습니다. 우리는 고해상도 쉘 전기영동과 Illumina 기반 분석을 조합하여 잎 표면에 존재하는 RNA와 생물학적 스트레스에 반응하여 어떻게 변하는지 평가합니다. 최근 연구에 따르면 세포외 RNA가 곰팡이 및 박테리아 병원체에 의해 흡수되는 것으로 나타났지만, RNA 흡수의 기본 메커니즘과 이러한 흡수의 기능적 결과는 대부분 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다.

시작하려면 각 복제에 대해 6-7주 된 애기장대 식물을 섭취하십시오. 잎 표면 세척의 분리를 시작하기 전에 멸균 VIB에 실루엣 L-77을 추가합니다. 그런 다음 계량 실린더를 사용하여 준비된 VIB 용액 100밀리리터를 500밀리리터 스프레이 병에 옮깁니다.

가는 가위를 사용하여 애기장대 로제트를 뿌리에서 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 부드러운 솔을 사용하여 꽃잎에서 과도한 흙을 제거합니다. 분리된 로제트를 멀축 표면이 위쪽을 향하도록 평평한 트레이에 놓습니다.

그런 다음 VIB와 습윤제로 채워진 스프레이 병의 5개 펌프를 사용하여 비축 표면을 분사합니다. 로제트를 조심스럽게 뒤집고 adaxial 표면에 분사합니다. 바닥에 구멍이 있는 변형 주사기를 목에 파라 필름으로 감싸 팁을 병 바닥 위에 매달아 준비합니다.

잎 표면 세척을 복구하려면 분사된 로제트를 250밀리리터 원심분리기 병 안에 놓인 바늘 없는 60밀리리터 변형 주사기에 부드럽게 삽입하고 주사기에 완충액 펌프 2개를 분사합니다. 그런 다음 적재된 병을 섭씨 4도에서 10분 동안 100G으로 원심분리합니다. 이제 회수된 잎 표면을 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통해 세척하고 얼음 위에 보관한 50밀리리터 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다.

잎 표면 면봉 방법의 경우 이전 단계에서 설명한 것과 동일한 방식으로 분리된 로제트에 VIB 및 습윤제 용액을 분사합니다. 잎 표면 면봉을 회수하려면 멸균 면봉 스틱을 사용하여 로제트의 아축 및 비축 표면을 모두 면봉으로 닦습니다. 그런 다음 적신 팁을 15밀리리터 원심분리기 튜브의 내벽에 대고 눌러 액체를 추출합니다.

추출된 잎 표면 면봉 샘플을 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통해 얼음 위에 놓인 2밀리리터 튜브에 걸러냅니다. 이전에 잎 표면 세척 또는 면봉 분리에 사용된 것과 동일한 식물 세트를 깨끗한 비커에 넣고 증류수로 부드럽게 두 번 헹굽니다. VIB로 로제트를 진공 청소기로 침투시키려면 헹군 로제트를 300-500밀리리터의 VIB가 들어 있는 프렌치 프레스 커피 메이커에 조심스럽게 넣으십시오.

뚜껑을 단단히 닫고 로제트가 완전히 잠길 때까지 플런저를 부드럽게 내립니다. 프렌치 프레스를 진공 챔버에 삽입하고 식물이 잘 스며들 때까지 진공 펌프를 사용하여 20초 동안 진공을 가합니다. 진공청소기를 푼 후 챔버에서 프렌치 프레스를 제거하고 뚜껑을 제거합니다.

VIB를 500밀리리터 플라스틱 비커에 붓고 로제트를 제거합니다. 그런 다음 로제트를 부드럽게 흔들고 종이 타월에 잎을 닦아 과도한 완충액을 제거합니다. 이제 압지를 사용하여 잎 표면을 부드럽게 닦아 남아 있는 완충액을 제거합니다.

비플라스틱 세척액을 수집하려면 VIB 침투 로제트를 이전에 수행한 것처럼 250밀리리터 원심분리기 병 안에 넣은 60밀리리터 바늘 없는 주사기에 삽입합니다. 병을 섭씨 4도에서 30분 동안 600G에서 천천히 가속하여 원심분리합니다. 그런 다음 얼음 위에 놓인 0.22밀리리터 튜브에 있는 15마이크로미터 주사기 필터를 통해 풀링된 비플라스틱 세척액을 여과합니다.

아크릴아미드와 비스 용액을 사용하여 트리스보산 EDTA 완충액에 10% 또는 15% 폴리아크릴아미드와 7몰 요소를 포함하는 미니 겔을 준비하거나 구입합니다. 그런 다음 RNA 샘플을 2배 변성 로딩 완충액과 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 65도에서 5분 동안 가열한 후 즉시 얼음 위에 올려 놓습니다.

이제 약 1시간 15분 동안 220볼트를 적용하여 실온에서 0.5배 TBE 실행 완충액에서 RNA 샘플을 분리합니다. 그런 다음 사이버 골드 핵산 젤 염색제로 젤을 0.5배 TBE로 10분 동안 염색합니다. 젤을 증류수로 두 번 헹구고 이미징 시스템을 사용하여 이미지화합니다.

분리된 RNA 밴드를 정량화하려면 분석 및 겔 분석 메뉴의 Image J 문서에 있는 겔 분석 방법을 사용합니다. RNase 및 DNase free 물에서 세포 용해물 RNA를 희석하여 두 가지 기술 복제를 위한 RNA 표준물질을 준비합니다. 1.5배 사이버 금 핵산 겔 염색제를 제조하려면 pH 8에서 500밀리몰 트리스 HCL 완충액에 용해시킵니다.

마이크로플레이트 설치의 경우 각 웰에 99마이크로리터의 증류수를 추가합니다. 다음으로, RNA 샘플과 표준물질 모두에 대해 동일한 부피를 사용하여 각 웰에 1마이크로리터의 RNA를 추가합니다. 마지막으로 각 웰에 50마이크로리터의 사이버 금 용액을 추가합니다.

마이크로 플레이트 리더 매개변수를 설정하려면 3초 동안 선형 또는 궤도 흔들기를 선택합니다. 마이크로 플레이트 리더를 496나노미터의 여기 파장과 540나노미터의 방출 파장으로 형광 끝점 모드로 설정합니다. RNA 표준물질의 형광 강도 값을 사용하여 보정 라인을 구성합니다.

변성 RNA 겔 분석 결과 잎 표면 세척액과 재생성 세척액 샘플 모두 긴 RNA 종과 작은 RNA 종을 포함하여 광범위한 RNA 크기를 포함하는 것으로 나타났습니다. 재생 불량액과 잎 표면 세척액에서 분리된 총 RNA 양은 식물의 신선한 무게로 정규화했을 때 유사했습니다. 잎 표면 세척, 재생성 전환 세척 및 세포 용해물의 RNA 프로파일은 현저하게 다르며, 최소한의 세포내 RNA 오염을 확인하고 재생 불량 RNA가 확산된 저분자량 밴드로 고도로 처리됨을 보여줍니다. 0.001% 실루엣 L-77을 소포 분리 완충액에 첨가하면 습윤제가 없는 완충액에 비해 잎 표면에서 RNA 수율이 거의 두 배가 되었습니다.

그러나 이 농도를 0.01%로 증가시켜도 RNA 회수율이 더 향상되지 않았습니다. 동일한 잎을 두 번째로 세척하면 첫 번째 세척에서 얻은 RNA의 약 63%가 회수되었으며, 이는 잎 표면에 RNA 분비가 진행 중임을 나타냅니다. 형광 기반 마이크로타이터 플레이트 분석을 사용한 RNA 정량화는 사이버 금 및 RIBO 488 검출 방법 모두에 대해 RNA 농도와 높은 선형성을 입증했습니다.

우리는 tRNA 및 tRNA 유래 단편 또는 TDR이 분해에 대한 저항성 때문에 세포외 RNA에 특히 풍부하다는 것을 보여주었습니다. 따라서 우리는 이러한 TDR이 박테리아의 유전자 발현을 조절할 가능성이 있다고 믿습니다. 우리는 잎 표면 RNA의 세포 공급원과 이 잎 표면 RNase가 계획된 미생물 상호 작용의 맥락에서 수행할 수 있는 생물학적 역할을 식별하고자 합니다.