맨틀 세포 림프종에 대한 3D 모델로서 하이드로겔 종양 절편의 바이오프린팅

우리는 환자의 맨틀 세포 림프종 상태를 복제하기 위해 하이드로겔 기반 바이오프린팅 모델을 개발하여 치료에 어떻게 생존하고 반응하는지 더 잘 연구할 수 있습니다. 문제는 림프종을 위해 특별히 설계된 3D 모델을 바이오프린팅, 배양 및 분석하는 가장 좋은 방법을 찾는 것입니다. 약물 내성과 재발로 인해 맨틀 세포 림프종은 여전히 치료할 수 없습니다.

우리의 모델은 종양 이질성과 미세 환경이 약물 반응에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 맨틀 세포 림프종의 다른 3D 모델과 비교하여 우리 모델은 콜라겐과 Matrigel을 함유한 바이오잉크를 사용하여 림프절 내의 세포외 기질 섬유 네트워크를 모방합니다. 제시된 모델은 기존의 2D 세포 배양 시스템에 비해 생리학적 관련성을 향상시킵니다.

맨틀 세포 림프종에 대한 생물학적 및 치료적 연구를 모두 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 시작하려면 관심 세포에 적합한 바이오잉크를 준비하기 위한 재료를 수집합니다. 맨틀 세포 림프종 또는 MCL Jeko-1 세포의 경우 알지네이트와 콜라겐을 적절한 완충액에 혼합하여 1밀리리터의 바이오잉크를 얻습니다.

배양 플라스크에서 MCL 세포 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포를 0.4% 트리판 블루 용액과 1:1 비율로 혼합합니다. 세포 계수기 또는 노이바우어 챔버를 사용하여 생존 가능한 염색되지 않은 세포를 계산하고 바이오잉크 1밀리리터에 대해 1,400만 개의 세포에 해당하는 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.

계산된 부피를 신선한 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 340g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 제거하고 준비된 바이오잉크에 세포 펠릿을 재현탁하여 최종 세포가 함유된 바이오잉크를 생성합니다. 바이오 프린터를 켜고 3D 프린터 소프트웨어에 연결합니다.

소프트웨어를 사용하여 하이드로겔 종양 절편 청사진이 포함된 STL 파일을 엽니다. 각 하이드로겔 슬라이스의 직경이 8mm이고 높이가 1.5mm인지 확인하십시오. 그런 다음 채우기 밀도를 85%로 설정하고 프린터 헤드를 홈에 고정합니다.

이제 젤라틴 슬러리를 반쯤 채워질 때까지 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 일회용 정밀 물티슈를 사용하여 과도한 물을 제거하고 젤라틴의 공기 간격을 제거하여 안정적인 지지 욕조를 형성합니다. 세포가 함유된 바이오잉크를 2.5밀리리터 유리 주사기에 넣고 0.8밀리미터 무딘 노즐을 부착합니다.

주사기를 뒤집어 기포를 천천히 배출한 다음 준비된 주사기를 바이오프린터에 삽입합니다. 3D 프린터 소프트웨어를 사용하여 소량의 바이오잉크를 압출하여 흐름을 확인합니다. 노즐이 막히지 않도록 일회용 정밀 물티슈로 압출된 방울을 닦아냅니다.

그런 다음 젤라틴 지지대를 주사기 노즐 아래에 놓고 노즐이 젤라틴 지지대 바닥에서 2mm 위에 올 때까지 프린터 헤드를 내립니다. 3D 프린터 소프트웨어를 사용하여 인쇄 프로세스를 시작합니다. 인쇄가 완료되면 막힘을 방지하기 위해 일회용 정밀 물티슈를 사용하여 노즐에서 과도한 젤라틴 슬러리를 제거합니다.

인쇄된 하이드로겔 종양 조각이 있는 젤라틴 지지욕이 들어 있는 페트리 접시를 꺼내 멸균 뚜껑으로 덮습니다. 뚜껑이 있는 지지 욕조를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 넣어 젤라틴이 녹고 인쇄된 하이드로겔 종양 조각을 방출합니다. 그런 다음 세척 완충액과 세포 배양 배지를 섭씨 37도로 예열합니다.

젤라틴이 녹는 동안 2개의 웰에 10밀리몰 HEPES 및 14.4밀리몰 염화칼슘 세척 완충액을 채우고 2개의 웰에 예열된 세포 배양 배지로 채워 6웰 플레이트를 준비합니다. 젤라틴이 녹으면 멸균 주걱을 사용하여 하이드로겔 종양 조각을 세척 완충액으로 채워진 첫 번째 웰에 조심스럽게 옮깁니다. 각 웰에서 1분 동안 세척한 후 배지 함유 웰에 옮기고 각각 1분 동안 세척합니다.

하이드로겔 종양 조각을 배양하려면 6웰 플레이트 내부에 위치한 0.4마이크로미터 기공 크기 필터 지지대에 놓습니다. 필터 지지대 아래에 1.5밀리리터의 세포 배양 배지를 추가한 다음 건조를 방지하기 위해 각 하이드로겔 종양 조각 바로 위에 배지를 소량 떨어뜨립니다. 약물 처리의 경우 배양 배지에 원하는 양의 약물을 첨가하십시오.

마지막으로, 6웰 플레이트를 원하는 배양 기간 동안 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 설정된 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 하이드로겔 종양 절편은 3일간의 배양 기간 동안 구조를 유지했으며, 인쇄 후 기포가 존재했지만 배양 중에 사라졌습니다. 하이드로겔 슬라이스에서 3일 동안 배양한 Jeko-1 세포의 생존율은 80%였으며, 이는 88%에서 2D 현탁액에서 배양된 세포와 유의한 차이가 없었다. 프린팅 직후, Jeko-1 세포는 하이드로겔 슬라이스에 고르게 분포되어 있었고, 주로 TMRM 양성을 보였으며, 이는 생존율을 나타냈다.

소수의 세포만이 각각 세포사멸과 사망의 마커인 caspase-3 및 PicoGreen에 대해 양성이었습니다. 배양 3일 후, Jeko-1 세포는 클러스터를 형성했고 대부분 TMRM 양성을 유지했습니다. 하이드로겔 종양 절편은 독소루비신 치료 3일 후에도 구조적 완전성을 유지했습니다.

하이드로겔 슬라이스에서 배양된 Jeko-1 세포는 독소루비신 처리에 대한 반응으로 용량 의존적 생존력 감소를 보였습니다. 독소루비신의 절반 최대 억제 농도는 약 5.8마이크로몰의 하이드로겔 슬라이스에서 Jeko-1 세포에 대해 2마이크로몰에서의 현탁액 배양에 비해 더 높았으며, 이는 3D 배양에서 민감도가 감소했음을 나타냅니다. 독소루비신으로 처리된 하이드로겔 슬라이스의 라이브 형광 이미징은 미토콘드리아 막 전위의 손실을 나타내는 TMRM 신호 감소와 세포 사멸 증가를 나타내는 PicoGreen 신호 증가를 나타냈습니다.

배양 4일 후, 하이드로겔 슬라이스의 일차 MCL 세포는 43.6%의 생존율을 유지했으며, 이는 현탁액 배양에서 관찰된 19.6%보다 유의하게 높았습니다. 형광 이미징은 하이드로겔의 세포가 주로 TMRM 양성임을 나타냈습니다.