ELISA(Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 사용한 고형 조직의 cGMP(Cyclic Guanosine Monophosphate) 측정

Dechter Laboratory는 산화질소 대사를 연구합니다. 산화질소는 적응 항상성 캐스케이드를 통해 주기적인 GMP 형성을 자극합니다. 우리는 노화, 식습관 및 기타 요인이 이 캐스케이드에 어떤 영향을 미치는지 알아보는 것을 목표로 합니다. 이전 연구는 산화질소의 형성과 이를 연결하는 캐스케이드를 무시하는 데 따른 생리학적 효과에 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 프로토콜은 캐스케이드의 두 번째 메신저인 순환 GMP를 측정합니다. 우리의 프로토콜은 간단하고 접근 가능하며 다양한 조직 유형에 쉽게 적응할 수 있습니다.

[해설자] 시작하려면,

티슈 분쇄기, 핀셋, 숟가락을 드라이아이스 위에 10분 동안 놓습니다. 분쇄 중 손실을 설명하기 위해 과도한 돼지 조직의 무게를 측정하십시오. 드라이아이스 위에 놓인 냉각된 분쇄기로 조직을 옮깁니다. 액체 질소를 분쇄기에 부어 조직을 급속 동결하고 진행하기 전에 완전히 기화되도록 합니다. 그런 다음 분쇄기의 뚜껑을 다시 닫고 망치를 사용하여 15번 두드립니다. 이제 저울에 비드 균질화 튜브를 용기합니다. 식힌 숟가락과 핀셋을 사용하여 분쇄된 조직을 튜브로 옮깁니다. 0.1 일반 염산을 균질화 튜브에 피펫팅하여 마이크로리터 단위의 부피가 밀리그램 단위의 조직 질량의 배수가 되도록 합니다. 그런 다음 비드 밀 균질화기를 사용하여 조직 샘플을 균질화합니다. 시료 온도를 섭씨 4도를 유지하면서 균질액을 17,000g에서 30분 동안 원심분리합니다. 생성된 상청액을 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플 온도를 섭씨 4도로 유지하면서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 최종 상층액의 분취량을 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 9.9밀리리터의 ELISA 완충액을 표준 B라고 표시된 튜브에 피펫팅합니다. 표준 B 튜브에 100마이크로리터의 표준 원액을 피펫팅합니다. 균일한 서스펜션을 보장하기 위해 철저하게 소용돌이치십시오. 1,000마이크로리터의 용액을 표준 B에서 표준 1이라고 표시된 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 표준 0 및 표준 2에서 8까지 표시된 튜브에 500마이크로리터의 ELISA 완충액을 추가합니다. 소용돌이 표준 1. 그런 다음 500마이크로리터의 용액을 표준 2로 옮깁니다. 그런 다음 표준 2를 소용돌이치고 500마이크로리터의 용액을 표준 3으로 옮깁니다. 각 이전 표준에서 다음 표준으로 500마이크로리터를 계속 옮기고 표준 8이 준비될 때까지 각 판 후에 철저하게 소용돌이치십시오. 샘플의 아세틸화를 위해 50마이크로리터의 4몰 수산화칼륨을 250마이크로리터 샘플 분취량에 첨가합니다. 즉시 12.5마이크로리터의 무수아세트산을 첨가하십시오. 용액을 15초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 12.5마이크로리터의 4몰 수산화칼륨을 피펫팅하고 다시 소용돌이치게 합니다. 표준 0이라고 표시된 튜브에 100마이크로리터의 4몰 수산화칼륨을 첨가한 다음 즉시 25마이크로리터의 아세트산 무수물을 첨가합니다. 소용돌이 후 25마이크로리터의 4몰 수산화칼륨을 튜브에 피펫팅하고 잠시 소용돌이치게 합니다. 수산화칼륨 및 무수아세트산 첨가를 반복한 후 나머지 표준물질에 대해 소용돌이를 일으키고 ELISA 완충액과 아세틸화 샘플 분취량의 미리 정해진 비율을 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다. Vortex 표준 0. 표준 0의 50마이크로리터 분취량을 ELISA 마이크로플레이트의 NSB 및 B naught 웰로 지정된 5개의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 표준 0을 포함하는 두 개의 NSB 웰에 50마이크로리터의 ELISA 완충액을 추가합니다. 단일 피펫 팁을 사용하여 표준 8에서 시작하여 표준 1로 진행하는 중복 웰에 표준 1에서 8의 50마이크로리터 분취량을 추가합니다. 각 샘플을 소용돌이치십시오. 그런 다음 50마이크로리터를 적절한 우물에 이중으로 또는 세 대로 추가합니다. 이제 50마이크로리터의 아세틸콜린에스테라아제 추적자를 NSB, B naught, 표준 및 샘플로 지정된 모든 웰에 피펫팅합니다. 각 B naught, 표준 및 샘플 웰에 50마이크로리터의 항혈청을 첨가합니다. ELISA 플레이트를 덮고 섭씨 4도에서 18시간 동안 배양합니다. 배양 후 ELISA 플레이트를 폐기물 용기 위에 뒤집어 내용물을 폐기합니다. 세척 병을 사용하여 세척 완충액으로 웰을 채웁니다. 5초 동안 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 세척 완충액을 버리고 종이 타월에 남은 액체를 두드려냅니다. 이제 Ellman의 시약을 저장소로 옮깁니다. 빠르게 작업하여 다중 채널 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 Ellman 시약을 블랭크, NSB, B naught, TA, 표준 및 샘플 웰에 추가합니다. 5마이크로리터의 아세틸콜린에스테라아제 추적자를 TA 웰에 첨가합니다. 그런 다음 ELISA 플레이트를 파라필름으로 덮습니다. 빛이 보호되는 용기에 넣어 실온에서 60-90분 동안 교반하면서 배양합니다. 파라필름을 제거하고 412나노미터에서 광학 밀도를 판독합니다. 대조군의 돼지 간에서 순환 GMP 농도는 조직 그램당 약 0.0202나노몰이었습니다. 질산염 처리군에서 순환 GMP 농도는 조직 그램당 약 0.0364나노몰로 증가했습니다.