Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

녹농균에 의한 만성 감염은 항생제에 내성이 있으며 치료하기가 매우 어렵습니다. 우리의 목표는 효율적인 치료법의 발견을 가속화할 생체 내 모델을 개발하는 것입니다. 항균제는 대부분 시험관 내에서 스크리닝되며, 만성적으로 감염된 마우스에서 약물을 테스트하는 것은 복잡한 과제입니다. 이 두 가지 접근 방식 사이의 격차를 메우기 위해 우리는 부상당한 제브라피쉬 유충을 사용하는 대체 전임상 모델을 제안합니다. 녹농균의 임상 균주 사용을 기반으로 한 제브라피쉬의 지속적인 감염 모델은 항생제 내성을 재현합니다. 마이크로 주사는 일반적으로 제브라피쉬 유충을 감염시키는 데 사용되지만, 당사의 상처 방법은 자연 감염 모드를 반영하며 치료 화합물의 스크리닝에 매우 적합합니다.

[해설자] 시작하려면 다루기 쉽도록 두 개의 젓가락 위에 25게이지 바늘을 놓습니다. 실체 현미경을 사용하여 비정상적인 발달을 보이거나 생존할 수 없는 배아를 식별하고 제거합니다. 접시를 원을 그리며 움직여 남은 배아를 중앙에 모으십시오. 이제 두 개의 수직 방향의 바늘을 사용하여 각 배아를 분리하고 왼쪽 바늘을 꼬리에 위치시켜 몸을 곧게 유지합니다. 오른쪽 바늘로 척삭 가장자리를 한 번 잘라 지느러미를 제거합니다. 각 절단을 신속하게 완료하여 모든 배아가 10분 이내에 박테리아 용액에 담가지도록 합니다. 감염 절차를 위해, 녹농균 용액을 제2형 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 소용돌이치고, 밀리리터당 7개의 콜로니 형성 단위의 약 10의 10제곱으로 6웰 플레이트에 첨가한다. 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상처 입은 배아를 채취하여 박테리아 용액으로 옮깁니다. 6웰 플레이트를 섭씨 28도에서 1.5시간 동안 배양합니다. 배양 후 감염된 배아를 회수하여 세척을 위해 미생물학적 안전 아래에 놓습니다. 이제 유리 피펫으로 배아를 메틸렌 블루가 없는 10밀리리터의 생선 물에 옮기고 옮겨진 부피를 최소화하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 유리 피펫을 사용하여 배아를 메틸렌 블루가 없는 4밀리리터의 생선 물에 다시 옮기고 잠시 배양합니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 감염된 배아를 24웰 플레이트에 개별적으로 옮기고 각 웰에 메틸렌 블루가 없는 생선 물 1밀리리터를 추가합니다. 24웰 플레이트를 섭씨 28도로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 감염된 각 유충에 대해 95마이크로리터의 1X PBS가 포함된 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브를 준비합니다. 유충을 메틸렌 블루가 없는 생선 물 4밀리리터가 들어 있는 6웰 플레이트에 옮겨 플랑크톤 박테리아를 씻고 제거합니다. 세척된 각 배아를 PBS가 있는 미세 원심분리기 튜브에 넣고 가능한 한 적은 양의 액체를 옮깁니다. 이제 유봉을 사용하여 각 배아를 미세 원심분리기 튜브의 측면에 대고 분쇄하고 나중에 유봉을 튜브 안에 남겨 둡니다. 그런 다음 유봉을 들어 올리고 100마이크로리터의 2% PBS Triton을 첨가하여 유봉에서 잔류 박테리아를 헹구고 최종 농도 1%에 도달합니다. 튜브를 소용돌이치고 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 배아에서 희석되지 않은 용해물 10마이크로리터 3방울을 LB 한천 플레이트에 분배합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 용해물을 최대 10까지 마이너스 3 희석제곱으로 연속적으로 희석합니다. 마지막으로, 희석되지 않은 부분 옆에 10마이크로리터 희석액 3방울을 떨어뜨립니다. 그리고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 4가지 낭포성 섬유증 녹농균 분리주 모두 PAO1 참조 균주에 비해 손상된 배아 모델에서 독성이 유의하게 낮았습니다. 2개의 분리주에 감염된 배아에서 박테리아 부하가 3일 동안 현저하게 감소하여 박테리아 제거를 나타냅니다. 대조적으로, 다른 두 분리주인 B6513 및 RP73은 초기 하락 후 감염 후 18시간에서 65시간 동안 비교적 안정적인 박테리아 부하를 유지하여 지속성을 시사합니다. 감염 후 1.5시간에 토브라마이신으로 30분의 짧은 치료를 통해 분리주 B6513에 감염된 배아의 박테리아 부하가 크게 감소했습니다. 토브라마이신은 감염 후 24시간 또는 48시간에 투여했을 때 박테리아 부하에 유의미한 영향을 미치지 않았으며, 지속적인 감염 단계에서 내성을 보였습니다.