Ookluc: 투과 차단 화합물 식별을 위한 Plasmodium berghei 라인

우리의 연구는 말라리아 전파를 차단하기 위한 새로운 전략을 지원하기 위해 고처리량 시스템을 사용하여 Plasmodium 성병 성단계에서 전염 차단 화합물과 필수 유전자를 식별하고 특성화하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 수정 후 기생충 발달의 발광 단계 자동 검출이 있는 형질전환 P.berghei 계통을 사용하여 전염 차단 화합물을 식별하기 위한 표준화된 고처리량 방법의 부족을 해결합니다. 이 프로토콜은 Plasmodium 성병의 성적 단계를 스크리닝하고, 조기 전염 차단 화합물을 검출하며, 정확한 IC50 결정을 지원하여 기존 방법에 비해 이점을 제공합니다.

시작하려면 ookinete 배지를 사용하여 화합물 스톡을 1밀리몰로 희석하여 화합물 샘플을 준비합니다. 이 1밀리몰 스톡을 오키네트 배지에 1:100의 비율로 희석하여 10마이크로몰의 최종 농도를 달성하여 작업 샘플을 준비합니다. 한 번의 분석의 경우 최종 부피 200마이크로리터의 작업 샘플을 이중으로 준비합니다.

화합물이 물 이외의 용매에 용해된 경우, 시험 시료에 사용된 것과 동일한 비율로 오키네트 배지에서 용매를 희석하여 대조군 시료를 준비합니다. 두 개의 96웰 플레이트를 사용하여 각 샘플의 80마이크로리터를 지정된 웰에 양성 대조군, 음성 대조군, 용매 대조군 및 테스트 샘플을 주어진 레이아웃에 따라 이중으로 배치합니다. 음성 대조군 웰을 제외하고 4마이크로리터의 기생된 마우스 혈액을 각 웰에 1:20 비율로 추가합니다.

위아래로 피펫팅하여 부드럽게 균질화합니다. 음성 대조군의 경우, 감염되지 않은 마우스 혈액을 각 웰에 1 대 20 비율로 첨가하고 피펫팅을 통해 부드럽게 균질화합니다. 플레이트를 섭씨 21도로 설정된 인큐베이터에 넣고 6시간 또는 24시간 동안 배양합니다.

배양 후 적절한 혈액 배지 혼합을 보장하기 위해 위아래로 피펫팅하여 각 샘플을 균질화합니다. 사용 직전에 용해 완충액과 루시페라아제 기질 혼합물을 1 대 50 비율로 준비하십시오. 이 용해 완충액 기질 혼합물을 각 샘플과 1:1 비율로 혼합하여 기포를 발생시키지 않고 부드럽게 혼합합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 이제 샘플을 96웰 흰색 평평한 바닥 플레이트로 옮기고 플레이트 리더를 사용하여 발광을 측정합니다. 발광 분석 후 플레이트 리더에 의해 표시된 원시 발광 데이터를 기록합니다.

스프레드시트를 사용하여 주어진 공식을 사용하여 각 측정값의 평균을 계산합니다. XX를 첫 번째 측정 셀의 주소로 바꾸고 YY를 두 번째 측정 셀의 주소로 바꿉니다. 모든 샘플에 대해 수식을 반복합니다.

주어진 공식을 사용하여 데이터를 백분율 억제로 변환합니다(여기서 A는 샘플 상대 조명 단위 값이고 B는 제어 상대 조명 단위 값입니다). 억제 농도 50% 측정을 위해 95% 이상의 억제를 나타내는 화합물을 선택하십시오. 마우스를 Ookluc로 감염시키고 기생 혈액을 채취한 후, 전환 억제를 100% 나타낸 초기 농도에서 희석제로 Ookinete 배지를 사용하여 화합물 샘플을 준비합니다.

지정된 레이아웃에 따라 샘플을 96웰 플레이트에 세 번 피펫팅합니다. 피펫을 사용하여 웰 D1에서 D2로 80마이크로리터를 옮기고 완전히 혼합한 다음 D2에서 D3으로 80마이크로리터를 옮기고 이 과정을 D12까지 계속하여 2배 연속 희석을 수행합니다. 웰당 80마이크로리터를 유지하기 위해 D12에서 제거된 최종 80마이크로리터를 버립니다.

이제 기생된 마우스 혈액을 각 웰에 1:20 비율로 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 균질화합니다. 음성 대조군 웰에 감염되지 않은 마우스 혈액을 1:20 비율로 추가하고 부드럽게 균질화합니다. 플레이트를 섭씨 21도로 설정된 인큐베이터에 넣고 발광 분석을 수행하기 전에 6시간 또는 24시간 동안 배양합니다.

백분율 억제를 계산한 후 분석 소프트웨어를 열고 플로팅을 위한 XY 테이블을 만듭니다. y축을 설정하여 나란히 하위 열에 세 개의 반복 값을 입력합니다. x는 화합물 농도를 나타내고 y는 백분율 억제를 나타내는 데이터를 테이블에 붙여넣습니다.

이제 분석을 클릭합니다. 비선형 회귀, 곡선 적합을 선택한 다음 용량-반응 곡선, 억제, 억제제 대 정규화된 반응, 가변 기울기를 차례로 선택하고 확인을 클릭합니다. 왼쪽 패널에서 선량-반응 곡선을 보고 색상 또는 포인트 형식 변경과 같은 사용자 정의를 적용합니다.

비선형 적합 테이블을 찾아 계산된 IC50 및 95% 신뢰 구간을 찾습니다. 피리미딘 아제핀 90은 0.125에서 1마이크로몰 사이의 농도에서 관찰된 95% 이상의 억제와 0.007마이크로몰 미만의 활성의 완전한 상실로 표적 활성의 명확한 농도 의존적 억제를 입증하여 억제 반응에서 급격한 역치 효과를 시사합니다. 피리미딘 아제핀 90 데이터에 적합한 용량-반응 곡선은 0.013마이크로몰의 IC50 값을 산출하여 표적 활성을 억제하는 데 높은 효능을 나타냅니다.