자기 입자 이미징을 사용한 폐 섬유증에 대한 이식된 원위 폐 상피 전구 세포의 이미지 유도 생체 내 추적

본 연구는 폐 세포 치료의 핵심 전달 방법으로 기관내 삽관 프로토콜에 초점을 맞추며, 폐섬유증에서 자기 입자 영상을 이용한 세포 이식과 비침습적 추적을 최적화하는 것을 목표로 합니다. 우리 프로토콜은 기관내 단열과 자기 입자 영상을 결합하여 세포 분포를 모니터링함으로써 폐섬유증에서 세포 치료의 생체 내 추적을 위한 비침습적 방법 부족을 해결합니다. 저희 프로토콜은 기관 내 설치를 통한 정밀한 국소 세포 전달과 자기 입자 영상을 통한 우수한 추적 기능을 제공하여 고감도 실시간 영상 및 배경 잡음 없는 영상을 제공합니다.

우선, 12주 된 수컷 NOD 또는 SCID 마우스의 무게를 재고 필요한 블레오마이신 용량을 계산합니다. 블레오마이신 용액을 멸균 식염수에 원하는 농도로 1.7밀리리터 마이크로 원심분리관에 최종 50마이크로리터로 준비합니다. 그 후 용액을 피펫에 주입하세요.

주사기에 200마이크로리터의 공기를 미리 담아 주입 시 전체 액체가 기관으로 배출되도록 하세요. 마우스를 마취한 후, 광섬유 탐침을 후두경과 카테터에 통과시켜 섬유 광기관 삽관 키트를 조립하세요. 동물의 발가락을 꼬집어 적절한 마취를 확인하고, 마취 상태일 때마다 양쪽 눈에 안과 연고를 발라줍니다.

쥐를 앞니로 누운 자세로 각도가 있는 설치류 삽관 스탠드에 매달아 놓으세요. 둔탁한 겸자를 사용해 혀를 잡고 부드럽게 위쪽과 왼쪽으로 움직여 후두를 노출시켜 명확하게 시각화하세요. 광섬유 탐침을 켜고 입 안으로 유도해 기관 쪽으로 접근하세요.

후두경의 확대경을 사용해 가시성을 높이고 기관 입구의 성대를 식별하세요. 카테터를 기관 입구에 삽입하고 후두경을 부드럽게 제거하세요. 그 다음 카테터 상단에 20마이크로리터 식염수 방울을 놓습니다.

200마이크로리터의 공기가 미리 담긴 주사기를 부착하고 방울을 기관에 밀어 넣으세요. 다음으로, 최대 50마이크로리터의 블레오마이신을 카테터에 주입하고 공기 주사기로 주입하세요. 기관에서 액체가 역류하는 것을 방지하기 위해 카테터를 5-7초 동안 제자리에 두세요.

그 후 카테터를 부드럽게 제거하세요. 생쥐를 삽관 스탠드에 최소 30초 이상 같은 자세로 유지하세요. 그 다음 스탠드에서 마우스를 꺼내 온열 패드 위에 위치한 회복 케이지에 넣으세요.

마취에서 완전히 회복할 때까지 쥐를 계속 관찰하세요. 특발성 폐섬유증 환자로부터 나노입자 표지된 인간 기도 상피 세포를 얻습니다. 블레오마이신 삽입 72시간 후 마우스를 재마취하고 기관내 삽입 절차를 반복하여 50마이크로리터 세포 부탁액에 50,000개의 세포를 투여합니다.

쥐가 최소 20분간 회복할 시간을 두고, 자기 입자 영상을 찍으세요. 마취 라인을 올바른 커넥터를 통해 침대 밑으로 통과시킨 후 자기 입자 영상 스캐너에 마우스 베드를 설치하세요. 쥐가 마취되는 동안 자기 입자 영상 스캐너를 준비하세요.

발가락 집어 검사로 충분한 마취를 확인한 후, 마우스를 자기 입자 영상 침대 위에 조심스럽게 위치시킵니다. 마우스로 베드를 스캐너 구멍에 밀어 넣고 소프트웨어 인터페이스에서 스캔 시작 버튼을 클릭하면 이미징이 시작됩니다. 스캔이 끝나면 마우스를 자기 입자 영상 베드에서 꺼내 온열 패드 위에 위치한 회수 케이지에 넣습니다.

마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 획득한 이미지를 분석합니다. 2D 자기 입자 영상(MPI) 신호 강도는 모든 검사된 세포 수에서 산화철 추적자의 농도가 증가함에 비례하여 증가했습니다. 최적의 표지 농도로 250 마이크로그램/밀리리터가 선택되었습니다.

형광 현미경 검사에서 세포질에서 붉은 덱스트란 신호와 청색 DAPI 염색 핵에서 성공적인 시험관 표지가 확인되었습니다. 2D MPI 이미지에서 신호 세기는 표지된 세포 수가 증가함에 따라 증가하여 신호와 세포 수 간의 양의 상관관계를 확인했습니다. 이를 바탕으로 5만 개의 세포가 이식 대상으로 선정되었습니다.

빈 침대 대조 이미지에서는 배경 MPI 신호가 없어 스캐너가 표지된 세포에 특이적임을 확인했습니다. 관찰된 네 가지 신호는 통제군으로 사용된 피듀셜 마커에 해당합니다. 표지된 세포를 폐로 성공적으로 이식하여 양쪽 폐에 눈에 띄게 분포하는 독특한 나비 모양의 MPI 신호를 생성하여 효과적인 기관내 전달을 입증하였습니다.

세포 설치가 불완전하여 폐와 목 부위에 신호가 나타나 조기 카테터 제거로 인한 누출을 나타냈습니다. 카테터가 기관이 아닌 식도에 잘못 삽입되면서 MPI 신호가 복부 하단으로 나타나 위 내 세포 침착을 나타냈습니다. 이식 14일 후, 적출된 폐의 체외 영상 검사에서 표지된 세포가 지속됨이 확인되었습니다.

우리의 연구 결과는 진단 정확도를 높이고 줄기세포 치료를 포함한 폐 질환에 대한 표적 치료법 개발을 가능하게 하여 폐 영상 및 관련 생의학 분야의 발전과 혁신을 가속화할 것입니다. 우리 연구실은 폐섬유증에 대한 줄기세포 기반 치료법을 보강하고, 비침습적 영상 기술을 향상시키며, 폐섬유증에 대한 세포 전달 최적화와 치료 효과를 모니터링하는 데 중점을 둘 것입니다.