자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제를 예비 스크리닝하기 위한 형광 기반 프로토콜. 단백질 합성은 매우 조절된 전사 및 번역 과정을 포함합니다. 전사는 주로 전사 인자, 염색질 변형, 조절 RNA에 의해 조절됩니다.

번역은 개시 인자, 신호 전달 경로, RNA 안정성 메커니즘에 의해 조절됩니다. 이러한 조절 시스템은 세포가 세포 기능을 유지하고 스트레스나 손상에 효과적으로 반응할 수 있도록 합니다. 암세포는 높은 에너지 요구와 통제되지 않은 성장을 지원하기 위해 번역 기계를 탈취하여 단백질 합성을 조절하지 못합니다.

이 재프로그래밍은 거의 모든 주요 종양 유발 신호 경로의 조절 불균형으로 인해 세포 생존, 증식 및 전이를 촉진하는 반면 세포 사멸 경로를 억제합니다. 이 단백질 합성 증진은 암 생존에 매우 중요하기 때문에, 이 과정을 표적으로 하고 차단하는 치료법이 잠재적인 치료법으로 기대됩니다. 단백질 합성 억제제를 식별하기 위해 다음과 같은 단백질 합성 억제 형광 분석 방법을 사용할 수 있습니다.

실험을 시작하기 전에, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 화합물을 독성 임계값 이하의 적절한 농도로 투여해야 합니다. 시작 농도를 확정하기 위해서는 세포독성 검사를 수행하여 화합물의 EC 50을 결정해야 합니다. 만약 이 방법이 불가능하다면, 이 분석법의 화합물은 용량 의존적 방식으로 시험하여 가장 효과적인 농도 매개변수를 결정할 수 있습니다.

화합물의 농도가 세포 사멸을 유발한다면, 낮은 농도에서의 검사가 필요해집니다. 사용하지 않을 때는 항상 빛으로부터 염료를 보호하는 것도 중요합니다. 장시간 빛 노출은 광표백을 초래하여 데이터 품질이 저하됩니다.

3.1단계, 마스터 믹스 A를 준비하고, 원심분리관을 A로 표지한 후 598.5 마이크로리터의 배양 배양지와 1.5마이크로리터의 단백질 표지를 A에 피펫 주입합니다. 이 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 균질성을 위해 재현탁합니다. 이제 마스터 믹스 B를 준비하세요. 원심분리관에 B로 라벨링하고, 단백질 라벨 1.5마이크로리터, 사이클로헥시마이드 6.6마이크로리터, 배양지 591.9마이크로리터를 B에 피펫팅합니다. 이 혼합물을 다시 현탁하여 위아래로 피펫팅하여 균질성을 보장합니다. 테스트 화합물 1마이크로리터와 차량 1마이크로리터를 두 웰에 피펫팅한 후, 마스터 믹스 A 99마이크로리터를 두 웰에 부드럽게 피펫팅하고, 웰 측면에 각도를 두고 피펫을 통해 세포의 운동학적 교란을 방지합니다.

마스터 믹스 B 100마이크로리터를 두 개의 처리되지 않은 웰에 피펫 주입하세요. 피펫을 웰 측면에 각도를 두고 삽입하여 세포의 운동학적 교란을 방지합니다. 원하는 성분을 세포 내에 완전히 포함시키기 위해 플레이트를 부드럽게 두드리세요.

세포를 37도 섭씨에서 30분에서 2시간 동안 배양합니다. 흡입으로 배양지를 제거하세요. 플레이트를 기울이고 웰 중앙 대신 측면에서 흡입하여 세포의 운동학적 교란을 방지하세요.

그 다음 각 웰에 100마이크로리터의 PBS 버퍼를 넣고 900g에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후에는 흡입을 통해 PBS 버퍼를 제거하는 것을 잊지 마세요. 5단계, 고정과 투과.

각 웰에 100마이크로리터의 고정액을 추가하세요. 그 후 세포를 어두운 환경에서 15분간 실온에서 배양합니다. 그 다음 세포를 흡인하세요.

세포를 100마이크로리터 세척 완충제로 세척한 후 흡인으로 제거하세요. 이 과정을 두 번 반복하세요. 각 우물에 100마이크로리터의 투과성 완충제를 추가하세요.

그 후 실온에서 10분간 배양합니다. 흡인을 통해 투과성 완충제를 제거하세요. 6단계, 단백질 반응과 염색.

반응 칵테일 마스터 믹스를 준비하세요. 원심분리관에 651마이크로리터의 PBS 버퍼를 추가하세요. 그 다음 100x 구리 시약 7마이크로리터를 추가하세요.

그 다음 형광 아지드 7마이크로리터. 마지막으로 원심분리관에 환원제 35마이크로리터를 넣습니다. 시약을 추가할 때 정확한 순서를 따르고, 각 웰에 반응 칵테일을 100마이크로리터 추가하세요.

세포를 실온의 어두운 환경에서 30분간 배양하여 광표백을 방지하세요. 세포를 900g에서 5분간 원심분리하세요. 흡인하고, 세포를 세척한 후 다시 흡인하세요.

총 DNA 염색액의 1배 희석액을 준비하고 각 웰에 100마이크로리터를 추가하세요. 광표백을 방지하기 위해 실온에서 어두운 환경에서 20분간 세포를 배양합니다. 플레이트를 900g에서 5분간 원심분리하세요.

세포를 100마이크로리터의 세척 버퍼로 세척한 후 흡입으로 제거하세요. 이 단계를 두 번 반복하세요. 마지막으로, 세포를 100마이크로리터의 차가운 PBS 완충액으로 재현탁하여 영상 촬영을 준비합니다.

8단계, 영상 촬영. 플레이트를 플레이트 리더기에 넣고 배율을 20배로 설정하세요. GFP 469/525 나노미터 채널로 핵 염색을 분석하세요.

자동 굽힘과 자동 초점을 사용해 영상 결과를 향상시키세요. 텍사스 레드 586/647 나노미터 채널로 활성 단백질 합성을 분석합니다. 자동 굽힘과 자동 초점을 사용해 영상 결과를 향상시키세요.

형광 탐침은 광표백에 민감한데, 이는 빛이 포함된 방사선이 형광체의 형광 특성을 잃게 하는 현상입니다. 염료는 사용하지 않을 때는 항상 빛으로부터 보호해야 합니다. 또한 각 우물 내 스캔 횟수와 방사선 빛 하에서의 시간을 제한해야 합니다.

장시간 빛 노출은 광표백을 초래하여 결국 데이터 품질 저하로 이어집니다. 대표적인 결과를 살펴보겠습니다. 여기서 살아있는 세포는 녹색으로 표시되며, 활성 단백질 합성은 빨간색으로 표시됩니다.

알려진 단백질 합성 억제제인 사이클로헥시마이드는 그림 1B에서 볼 수 있듯이 음성 대조군 DMSO에 비해 단백질 합성을 크게 감소시키며, 적색 형광 방출량이 줄어듭니다. 그림 1C에서 볼 수 있는 1번 화합물 치료는 세포 박리 또는 세포 사멸을 초래했습니다. 따라서 단백질 합성 억제 활성에 대해 명확한 주장을 할 수는 없습니다.

이는 낮은 농도에서 단백질 합성을 억제하는지 여부를 확인하기 위한 추가 용량 반응 연구가 필요합니다. 화합물 2는 그림 1D에서 나타난 것처럼 중간 정도의 단백질 합성 억제를 보입니다. 이 형광측정 분석법은 학부생 교육에 유용한 연구 도구이자 접근성 높은 화학생물학 방법입니다.

최소한의 데이터 처리로 접근하기 쉽고 효율적인 프로토콜을 제공함으로써, 학생들에게 실습 경험과 현대적인 신약 개발 기법을 제공하고 신약 개발 과정을 가속화합니다. 프로토콜은 형광 기판과 첨단 형광 현미경 기법을 활용하여 천연물 화합물 1번과 2번의 억제 능력을 체계적으로 검출하고 측정합니다. 사이클로헥시마이드를 기준으로 사용했을 때, 두 천연 산물 모두 단백질 합성 억제 수준이 다양하게 나타났습니다.

새로운 단백질 합성 억제제에 대한 수요가 증가함에 따라, 이 접근법은 학부생들에게 의미 있는 연구 기회를 제공하고 암 치료제의 발전에 기여합니다.