Name: 이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 철산화물 기반 조영제를 이용해 인간 중간엽 및 배아줄기세포를 라벨링하고 MR 영상으로 비침습적 생체내 추적하는 방법을. 이 기술은 줄기세포 치료 평가에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소에서 레온 J. Thal 시드 부여에 의해 지원되었다. 토바 이어스 헤닝는 독일 연구 협회 (DFG, HE 4578/1-2)에서 급비 연구에 의해 투자되었다. 우리는 기꺼이 그 인간의 배아 줄기 세포의 문화에 대한 그의 조언 후아의 Meneses을 인정 싶어요.

Ferucarbotran과 hMSC의 라벨링 이것은 Ferucarbotran, MR 영상을위한 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트 인간 mesenchymal 줄기 세포를 라벨에 대한 기술입니다 <ol><li> 시작하려면, 플레이트 18~24시간 80 % 합류에 T75 flasks의 라벨 절차 이전에 세포. 다른 문화 접시를 사용하는 경우이 cm 2 당 10000에 대한 세포 같습니다. </li><li> 그 다음날, 혈청 무료 미디어 8 ML에 Resovist 30 μl를 추가하여 라벨 미디어를 준비로 시작합니다. 이것은 100 μg 철 / ML 미디어의 농도에 해당, confluency 80% 하나 T75 플라스크 레이블을 것입니다. </li><li> 문화 미디어를 벗고 PBS 또는 혈청 무료 미디어 번 세포를 씻으십시오. 이것은 잔류 혈청 단백질과 대비 에이전트와 영향력 라벨 효율을 바인딩할 수있는 미디어의 다른 성분을 제거하기위한 것입니다. </li><li> 술병에 상표 미디어를 추가하고 인큐베이터에있는 술병을 돌려 넣어. </li><li> 2 시간 후에, 20 % FCS의 최종 농도가 달성되도록 FCS의 2ml를 추가합니다. 이것은 세포가 차별 자극을받지 않도록 할, 대신 자신의 친숙한 환경에서 성장합니다. </li><li> 18시간을 통해 세포를 품어. 이것은 최고의 하룻밤 완료됩니다. </li><li> 다음날, PBS로 세포를 씻어 후, 그들이 평소 trypsinize. </li><li> 일단 trypsinized, 세포 현탁액은 미디어 잔류, 무료 대비 에이전트 없애 3 번 세탁해야합니다. 이것은 PBS 5 분 400 RCF에서 세포를 centrifuging하여 이루어집니다. </li><li> 최종 세포 펠렛은 resuspended 더욱 실험을 준비하실 수 있습니다. </li><li> 일부는 이전의 세척 단계 중 손실되었을 수도로서 세포를 계산합니다. 또한, Trypan 파랑 제외 분석을 사용하는이 시점에서 생존 테스트를 수행하고 라벨 효율을 측정하는 spectrometric 분석을위한 샘플을 채취. </li></ol> Ferumoxides와 인간 배아 줄기 세포의 라벨링 <ol><li> 시작하려면, 플레이트 10cm 요리에 hESC, 평소처럼. 이들 요리는 젤라틴으로 미리 코팅하고 그들에게 조사 피더 세포를합니다. 당신은뿐만 아니라 피더없는 문화에 대해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. </li><li> 그들은 중간 크기의 식민지를 형성 있도록 hESC는 첨부하여 약 3-4일에 대한 성장하자. 큰 식민지 나중에 이혼하는 것이 더 어려울 있으므로이 기간 동안, 식민지 큰 성장을하지 않도록. </li><li> 차별화된 세포 너무 콜로니의 청결에 따라, 이러한 문화를 오염시킬 수있다, 당신은 절개로 차별 문화를 없애해야 할 수도 있습니다. </li><li> 100μg/ml 및 전체 hESC 미디어의 농도에 Ferumoxides 구성되어 라벨 미디어를 준비합니다. 이를 위해, 우리는 89μl Ferumoxides 및 전체 성장 미디어 10 ML을 섞는다. </li><li> 전체 미디어와 한 접시를 씻으십시오. </li><li> 요리마다 미디어를 라벨링 10 ML을 추가하고 4 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 이제 라벨이 완료됩니다. 다음 단계에서, 그것은 세포를 씻어 더욱 사용하기 위해 단일 ​​세포 현탁액을하는 것이 필요합니다. 이를 위해 먼저 PBS로 접시를 씻어. </li><li> 그런 다음, 0.25 %의 트립신의 5ml으로 PBS를 교체 5 분 동안 인큐베이터에서 부화하거나, 세포가 분리까지. 그것은 자주 접시를 도청하는 데 도움이됩니다. </li><li> 세포는 이제 분리했습니다. 요리가 큰 식민지가 포함된 경우 남은 대단히 짧은 시간이있을 것을 명심하십시오. </li><li> 이 대단히 짧은 시간을 없애, 하나 serological 피펫을 사용하여 한 번 전체 중지를 섞을 수 있습니다 다음, 그것이 다른 2 분 앉아 보자. </li><li> 우리는 세포 세포막을 깰 수있는 얇은 팁을 통해 세포의 반복으로 빨아을 Eppendorf 피펫을 사용하지 마십시오. </li><li> 잔여 대단히 짧은 시간이 존재할 경우, 하나는 40μm 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 실행할 수 있습니다. </li><li> 모든 올바르게 작동하는 경우, 단일 세포 현탁액 이제 ESC 매트릭스와 죽은 세포 젤라틴 코팅에서 발생하는, 파편의 많은 혼합되어 존재한다. 이 없애 5 분 400 RCF에서 그들을 회전하여 두 세포를 씻어 및 전체 미디어에서 그들을 resuspend. </li><li> 자, ESC는 조사 피더 세포로부터 격리해야합니다. 이것은 젤라틴 - 코팅 접시에 세포 현탁액을 도금하여 효율적으로 수행할 수 있습니다. </li><li> 접시가 조작하지 않으면, 모든 전지는 퇴적물 아래되지만 피더는 ESC보다 빠르게 연결할 수 있습니다. </li><li> 모이통가 주로 요리에 연결되어 있어야하는 동안, 그래서 뜨는 45 분 후에 이륙있다면, 그것은 주로 ESC를 포함해야합니다. </li><li> 이 방법은 추가 실험을 위해 사용할 수있는 자기 (磁 气)로 분류 인간의 배아 줄기 세포의 단일 세포 현탁액이 얻어진다. </li><li> 이전 프로토콜과 마찬가지로,이 시점에서, 당신은 세포를 계산하고 라벨 효율성 생존 능력의 평가와 측정을위한 샘플을 채취해야합니다. </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

줄기 세포의 비침습 묘사는 거의 모든 줄기 세포 기반 치료를 모니터링 중요합니다. 표시 줄기 세포의 생체내의 속도론에의 더 나은 이해로 MR 이미지에 대한 시각, 합리적인 방법과 줄기 세포 기반 요법보다 효과적인 사용을 초래할 수 있습니다. 우리가 임상 적용 대조 대리인 및 이미징 기술을 사용 이후, 우리의 제공 프로토콜은 환자의 어플 리케이션에 쉽게 번역되어야합니다. 우리의 방법의 잠재적인 임상 응용 프로그램 비교 다양한 줄기 세포 subtypes 또는 유전자 조작 줄기 세포의 engraftment 프로세스의 조사뿐만 아니라, 줄기 세포 engraftment의 결과에 대한 치료 효과의 평가를 포함합니다. 결과는 임상 연습에서이 줄기 세포 기반 요법의 평가에, 나중에 관련 임상 시험의 설계에 줄기 기반 요법의 잠복기 평가에 즉시 도움이 될, 그리고해야합니다. 참고, 우리의 이미징 기술은 또한 조혈 줄기 세포 또는 줄기 세포의 연결과 같은 다른 줄기 세포 집단에 적용됩니다.

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Gelatin을 PBS로 희석하여 최종 농도를 0.1 %로 조절함</td></tr><tr><td>PBS (Ca++ Mg++ freed)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS characterized</td><td>시약</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &amp;mu;m Nylon)</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>non-essential amino acids</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxides (Endorem)</td><td>시약</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferucarbotran (Resovist&amp;#174;)</td><td>시약</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

이런 산화물로 hescs과 hmscs을 라벨링하는 mr 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 nanoparticles

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

최근에는 줄기 세포 연구는 발달 생물학, 각종 질병 및 재생 의료에 미치는 잠재적인 영향을 더 잘 이해하게되었다. 생체내에서 반복 이식 줄기 세포를 모니터링하는 비침습 방법은 크게 메커니즘을 이해하는 능력을 향상시킬 것이라는 제어 줄기 세포 죽음과 줄기 세포 engraftment을 향상 영양 요인과 신호 경로를 확인합니다. MR 영상은 근처의 미세​​한 해부 해상도 줄기 세포의 생체내 묘사에 대한 효과적인 도구로 입증되었습니다. MR과 함께 줄기 세포를 감지하기 위해서는 세포가 세포 특정 MR 대비 요원으로 표시해야합니다. 이 목적 들어, superparamagnetic의 철 산화물 입자 (SPIO)으로 철 산화물 nanoparticles은, 때문에 세포 검출과 우수한 biocompatibility 위해 고감도의 적용됩니다. SPIO 입자는 철 산화물 코어와 T2 - 가중 MR 영상에서 감소 신호를 발생 지역 현장 inhomogeneities를 만들어 dextran, carboxydextran 또는 전분 코팅, 그리고 기능으로 구성되어 있습니다. 이 프레 젠 테이션은 MR 영상과 레이블 세포의 생체내 추적에 후속 비침습에 대한 임상 적용 MR 대비 에이전트와 함께 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

최근 몇 년 동안 줄기세포 연구는 발생 생물학 및 다양한 질병에 대한 이해를 높였으며, 재생 의학에 미칠 잠재적 영향력을...

Haiku Dal Link 박사의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 새로운 줄기세포 치료법 평가를 위한 본 프로젝트에 자금을 지원해 준 캘리포니아 재생의학 연구소(California Institute of Regenerative Medicine)에 감사드립니다. 주입된 세포를 체내에서 비침습적으로 추적하는 것은 매우 중요합니다.이는 MR 영상 또는 광학 영상물을 위한 특이적 또는 다기능 조영제로 세포를 in vitro에서 표지함으로써 가능합니다. 이 영상에서는 향후 in vivo 영상 촬영을 위해 인간 중간엽 줄기세포와 인간 배아 줄기세포를 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 방사선학과 분자 및 기능 영상 센터의 조영제 연구 그룹 소속 Tobias Henning입니다.오늘은 peric, carone을 이용한 인간 중간엽 줄기세포의 인 비트로(in vitro) 표지법과 phem oxides를 이용한 인간 배아 줄기세포의 표지법 절차를 보여드리겠습니다. 이 기술은 체내에 주입된 세포의 위치를 파악하거나 세포의 기능적 상태에 대한 정보를 얻는 데 유용합니다. MRI 조영제를 이용한 세포 표지 절차는 배아 줄기세포와 중간엽 줄기세포에 따라 다르지만, 두 기술 모두 다음과 같은 단계를 거칩니다. 세포 배양 준비(세포 배양 접시의 세포 부착), 표지 배지 준비, 단순 배양을 통한 세포 표지, 줄기세포의 트립신 처리 및 유리 조영제 세척, 표지 효율 및 세포 생존율 평가입니다.그럼 이제 세포 표지를 시작하겠습니다. 먼저 Theo Carbatrol을 사용하여 중간엽 줄기세포를 표지해 보겠습니다. 우선, MR 영상을 위한 철 산화물 기반 조영제인 theo carron을 사용하여 인간 중간엽 줄기세포를 표지하는 기술을 보여드리겠습니다.시작 단계로, 라벨링 절차 18~24시간 전에 세포를 T 75 플라스크에 80%의 합류도(confluence)로 플레이팅합니다. 또는, 다음 날 제곱센티미터당 약 10,000개의 세포가 되도록 하는 다른 배양 접시를 사용하는 경우, 8 mL의 무혈청 배지에 30 µL의 reservist를 추가하여 라벨링 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 이는 합류도 80%의 T 75 플라스크 1개를 라벨링할 수 있는 양이며, 배지 1 mL당 100 µg의 철 농도에 해당합니다. 이제 배양액을 제거하고 PBS 또는 무혈청 배지로 세포를 1회 세척합니다.이는 조영제와 결합

labeling-hescs-hmscs-with-iron-oxide-nanoparticles-for-non-invasive

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 형광 염료와 인간 배아 줄기 세포 및 mesenchymal 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 기술은 광학 이미징과 이식 줄기 세포의 생체내 추적에와 형광 현미경과 histopathological 상관 관계에 대해 사용할 수 있습니다.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

이 비디오에서는, 우리는 망간 염화와 인간의 배아 줄기 세포를 (hESC) (MnCl 라벨하는 방법을...

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

프레 젠 테이션의 목표는 MR 영상과 시각 수있는 연골의 결함에 매트릭스 관련 줄기 세포 이식을 생성하는 높은 재현성 방법을 입증하는 것입니다. 줄기 세포는 아가로 오스와 혼합 FDA 승인 Ferumoxides, 연골의 결함에 심어 및 7T MR 스캐너와 함께 몇 군데으로 표시됩니다.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

nanoparticles의 세포 biodistribution을 평가하는 데 사용 Bioimaging 방법은 nanoformulated 화합물의 치료 및 진단 모니터링에 적용할 수 있습니다. histological coregistration에 의해 평가하면 여기에 설명된 방법은 민감하고 구체적인 수 있습니다. 방법은 설치류에서 인간의 응용 프로그램에 translational 경로를 제공합니다.

진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

Ferumoxytol, FDA 승인 철 산화물 Nanoparticle과 함께 줄기 세포를 라벨링

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명...

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다.

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

표적 세포 전달은 다양한 생체 의학 응용 분야에서 유용합니다.  이 프로토콜의 목표는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 세포 전달 및 국소화를 높은 수준으로 제어할 수 있는 자기 세포 표적화 접근 방식을 가능하게 하는 것입니다.

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

여기에 제시된 비침습적 중간엽 줄기 세포(MSC) 전달 및 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 추적을 위한 프로토콜이 제시된다. 초파라마그네틱 산화물 나노입자는 실시간 MRI를 이용한 비강 내 전달 후 생체 내 추적 및 비침습적 MSC 라벨링을 위한 자기 공명 영상(MRI) 프로브로 사용된다.

외상성 뇌 손상 뮤린 모델에서 비강 내 전달 후 MRI를 사용하여 수퍼 파라마그네틱 철 산화물 표지 메젠키말 줄기 세포 추적

학습하세요 철산화물 기반 조영제를 이용해 인간 중간엽 및 배아줄기세포를 라벨링하고 MR 영상으로 비침습적 생체내 추적하는 방법을. 이 기술은 줄기세포 치료 평가에 활용됩니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

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