Chromobacterium violaceum에서 Violacein의 정량화 및 생리 활성 화합물에 의한 억제

우리의 연구는 주요 표현형을 조절하는 쿼럼 감지를 억제하는 화합물을 식별하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 박테리아 성장에 영향을 주지 않고 비올라세인 생산을 감소시키는 분자를 스크리닝하여 쿼럼 감지 간섭을 시사합니다. 최근 연구에서는 박테리아 성장에 영향을 주지 않고 쿼럼 감지를 억제하는 새로운 생리 활성 화합물을 확인하여 항생제 내성 박테리아에 대한 항독성제로서의 잠재력을 강화했습니다.

주요 과제는 화합물이 성장이나 형질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 쿼럼 감지 억제의 특이성을 포함합니다. 존중 및 용해도 영향 균형 정량화라고 하는 이 프로토콜에서는 신중한 취급이 필요합니다. 우리는 박테리아 성장에 영향을 미치지 않는 하위 억제 농도의 생리 활성 화합물에 사용되는 프로토콜을 확립했습니다.

이것은 항균 연구와 다른 쿼럼 감지 신호 전달을 시작하기 위한 핵심 전제입니다. 우리는 특히 식품 및 건강과 관련된 박테리아에서 새로운 정족수 상태 억제제를 식별하고 의사소통의 억제 메커니즘을 밝히는 데 중점을 둘 것입니다. 시작하려면 Luria Bertani 또는 LB 국물에서 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472의 5밀리리터 배양액을 배양합니다.

분당 220회전으로 설정된 쉐이킹 인큐베이터에서 섭씨 30도에서 배양하여 24시간 동안 배양합니다. 하룻밤 배양의 광학 밀도를 측정하고 밀리리터당 8 콜로니 형성 단위의 거듭제곱의 약 10배로 조정합니다. LB 국물을 사용합니다.

화합물 제조의 경우 생리 활성 화합물의 무게를 측정하고 용해도에 따라 순수 DMSO 또는 DMSO와 물의 일대일 혼합물로 희석합니다. 바닥이 평평한 96웰 플레이트를 가져다가 연속 희석 방식에 따라 생리 활성 화합물과 함께 LB 국물을 첨가합니다. 각 웰에서 원하는 농도에 필요한 원액의 부피를 계산하려면 공식을 적용하십시오.

각 시리얼 희석 세트의 첫 번째 열에서. 196마이크로리터의 Luria Bertani 국물을 3, 5, 7열에 추가합니다. 그런 다음 희석에 사용되는 후속 컬럼에서 100마이크로리터의 Luria Bertani 국물을 컬럼 4, 6, 8에 추가합니다.

연속 희석을 시작하려면 3, 5 및 7열에 해당하는 각 세트의 첫 번째 웰에 4마이크로리터의 생리 활성 화합물을 추가합니다. 혼합 후 각 웰에서 인접한 컬럼으로 100마이크로리터를 옮깁니다. 4열, 6열, 8열에 도달하는 연속 희석을 계속합니다.

교차 오염을 피하기 위해 새로운 팁을 사용하여 모든 화합물의 각 농도에 대해 전체 절차를 세 번 반복합니다. 모든 웰의 B-D 행에 80마이크로리터의 Luria Bertani 국물을 추가합니다. 우물당 총 180마이크로리터가 됩니다.

그런 다음 이전 제제에서 표준화된 크로모박테리움 비올라세움 배양액 20마이크로리터를 각 웰에 첨가하여 최종 부피 200마이크로리터에 도달합니다. 분광 광도계 호환성을 기반으로 합니다. 증발을 방지하기 위해 마이크로플레이트를 뚜껑이나 밀봉 필름으로 덮으십시오.

밀봉된 플레이트를 섭씨 30도에서 분당 130회전으로 교반하면서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 플레이트를 섭씨 60도로 설정된 건조 인큐베이터로 옮깁니다. 뚜껑을 열고 약 8시간 동안 완전히 건조시킵니다.

건조되면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 각 웰에 200마이크로리터의 순수 DMSO를 추가합니다. 플레이트를 덮고 섭씨 25도에서 분당 130회전으로 30분 동안 흔들어 비올라세인 색소를 녹입니다. 배양 후, 용해된 비올라세인 용액 100마이크로리터를 새 마이크로플레이트에 조심스럽게 옮깁니다.

피펫 팁과 우물 벽 사이의 접촉을 피하십시오. 오염을 방지하기 위해 뚜껑을 덮은 마이크로플레이트 분광 광도계에서 595나노미터에서 비올라세인의 흡광도를 측정합니다. 각 판독 전에 5초 동안 흔들어 오염을 방지하기 위해 뚜껑을 덮고 판독을 수행합니다.

비올라세인 생산량을 계산하려면 먼저 각 샘플에서 블랭크의 흡광도를 빼서 배경 간섭을 배제한 다음 처리되지 않은 대조군을 방정식의 기준으로 사용하여 비올라세인의 백분율을 계산합니다. 세 가지 생리 활성 화합물인 레스베라트롤, 파르네솔 및 리나룰은 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472에서 비올라세인 생성을 억제하는 능력에 대해 테스트되었습니다. Farnesol은 비올라세인 생산량을 밀리리터당 200마이크로그램에서 9%, 밀리리터당 100마이크로그램에서 19%로 크게 감소시켰는데, 이는 처리되지 않은 대조군의 100%와 비교됩니다.

밀리리터당 200마이크로그램과 100마이크로그램 모두에서 리나룰을 처리한 결과 비올라세인 생산이 32%로 나타났으며, 대조군에 비해 68%의 억제를 보였다. 밀리리터당 25마이크로그램의 레스베라트롤은 비올라세인 생산량을 15%로 감소시켰고, 밀리리터당 12마이크로그램에서는 처리되지 않은 대조군의 100%에 비해 30%에 도달했습니다. 마이크로플레이트 이미지는 처리되지 않은 대조군에 비해 모든 치료에 대해 감소된 비올라세인 색소 침착을 시각적으로 확인했습니다.