신경독성에 대한 판독으로서의 Drosophila melanogaster 의 운동 기능 장애에 대한 행동 분석

우리 연구의 목표는 신경독성 화합물의 스크리닝을 위한 비용 효율적이고 윤리적으로 유리한 방법을 개발하는 것입니다. 독성학 테스트의 전통적인 방법은 종종 가상 비율 모델에 의존하는데, 이는 우리가 알고 있듯이 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적 문제가 있습니다. 우리는 민감하고 확장 가능한 초파리 멜라노가스터와 같은 대체 모델을 사용하여 신경독성의 초기 징후를 감지할 수 있는지 여부를 탐구하고 싶었습니다. 이 프로토콜은 움직임 패턴 변화 및 hiperactivity와 같은 행동 표현형뿐만 아니라 점진적인 운동 저하 또는 보안 서면 중단을 감지하는 데 도움이 되며 광범위한 선호도도 테스트됩니다.

우리 프로토콜의 장점은 고전적인 등반 분석과 실시간 모니터링 기술을 결합하여 놓칠 수 있는 미묘한 운동 장애를 포착할 수 있다는 것입니다. 더 높은 감도와 더 정확한 행동 데이터를 제공하는 전통적인 방법을 사용합니다.

[해설자] 시작하려면 파리를 빈 병에 부드럽게 옮깁니다. 얼음으로 채워진 상자 안에 파리가 들어 있는 병을 넣고 병 전체가 덮이도록 합니다. 1분 후 병을 가볍게 두드려 모든 파리가 마취되었는지 확인합니다. 얼음으로 채워진 작은 용기를 준비하십시오. 얼음 위에 페트리 접시나 평평하고 깨끗한 표면을 놓아 차가운 플랫폼을 만듭니다. 이제 식힌 페트리 접시 위에 튜브를 뒤집고 가볍게 두드려 파리를 차가운 표면에 놓습니다. 파리를 빈 약병에 조심스럽게 옮깁니다. 파리가 섭씨 25도의 통제된 환경에서 30분 동안 마취에서 회복되도록 하고 12시간의 밝은 암흑 주기와 50% 습도를 유지합니다. 다음으로, 미세모세관 공급 준비를 위해 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 테스트 용액을 각 미세모세관 튜브에 수동으로 로드하여 모든 샘플에서 일관된 부피를 보장합니다. 실험 중 증발 및 누출을 방지하기 위해 각 미세모세관의 열린 끝에 3-5마이크로리터의 미네랄 오일을 추가합니다. 면병 플러그의 구멍을 통해 미리 채워진 미세 모세관을 삽입하여 단단히 고정되도록 합니다. 파리가 들어 있는 바이알을 섭씨 25도로 설정된 인큐베이터에 12시간 동안 밝은 암흑 주기로 넣고 실험 기간 동안 바이알을 인큐베이터에 그대로 둡니다. 12시간마다 파리를 깨끗하고 빈 약병에 옮겨 운동 활동을 평가합니다. 영구 마커를 사용하여 바이알 바닥에서 7cm 떨어진 선을 측정하고 표시합니다. 이 표시는 등반 목표 역할을 합니다. 등반 행동을 기록하기 위해 카메라나 휴대폰을 안정적인 위치에 배치하십시오. 선명한 가시성과 분석을 가능하게 하기 위해 적절한 조명과 투명한 배경을 보장하십시오. 실험 설정이 카메라의 시야와 호환되는지 확인하고 녹화를 시작합니다. 비디오 녹화를 검토하고 각 파리가 7cm 표시에 도달하는 데 걸리는 시간을 측정합니다. 앞서 그림과 같이 샘플과 미네랄 오일 씰로 공급 미세 모세관을 준비합니다. 그런 다음 길이가 약 6cm로 자른 투명 플라스틱 빨대를 사용하여 개별 이동 챔버를 준비합니다. 각 빨대의 한쪽 끝을 투명 필름으로 밀봉하여 밀폐 밀봉을 만듭니다. 빨대의 밀봉된 끝 부분 근처에 공급 미세모세관을 삽입할 수 있는 작은 구멍을 만들어 꼭 맞고 분석 중에 누출되거나 움직이지 않도록 합니다. 앞서 그림과 같이 파리를 마취하고 분리한 후, 고운 페인트 브러시를 사용하여 마취된 파리 한 마리를 각 튜브에 부드럽게 넣습니다. 각 튜브의 열린 끝을 투명 필름이나 면 플러그로 밀봉하여 공기 흐름을 허용하면서 누출을 방지합니다. 이제 지정된 구멍을 통해 준비된 각 챔버에 미리 채워진 미세 모세관을 삽입합니다. 조립된 튜브를 분석 경기장에 배치하고 매일 교체할 수 있도록 미세 모세혈관에 접근할 수 있도록 합니다. 전체 설정을 섭씨 25도로 유지되고 12시간의 밝은 암흑 주기와 50%의 습도가 있는 챔버 안에 놓습니다. 장치를 로컬 추적 시스템 또는 네트워크에 연결합니다. 소프트웨어 플랫폼에 액세스하여 실험에 할당된 장치를 찾습니다. 시스템이 시각적 마커를 기반으로 각 파리를 올바르게 추적하고 있는지 확인하십시오. 모든 실험 메타데이터를 입력하고 분석 기록을 시작합니다. 24시간 및 48시간에 음성 지유성 분석을 사용하여 평가한 등반 능력은 24시간에 대조군과 치료군 간에 유사한 성능을 보여 즉각적인 운동 결손이 없음을 나타냅니다. 48시간이 되면 치료받은 파리는 심각한 운동 장애를 반영하는 대조군에 비해 오르는 데 거의 두 배 더 오래 걸립니다. 지속적인 활동 추적에 따르면 치료받은 파리는 처음에는 움직임이 증가했지만 12시간 후에 활동이 급격히 감소하여 초기 과흥분성 후 운동 기능 감소를 시사합니다. 24시간에서 40시간이 지나면 처리된 파리는 대조군에 비해 움직임이 감소합니다. 전반적으로 처리된 파리는 40시간 동안 약 20% 활동이 감소했습니다. 치료받은 파리는 처음에는 빛 신호에 지연된 후 일시적인 일주기 정렬로 반응했지만 기관차 결함의 결과로 48시간 동안 점진적으로 리듬을 잃었습니다. 치료받은 파리는 대조군보다 라이트 존을 더 선호합니다.