Name: 시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 배우세요 상분리된 거대 단일층 소포 내부에서 세포골격 네트워크를 재구성하는 방법을. FtsZ와 액틴 번들을 캡슐화하여 합성 세포에서 단백질 기능을 유지하고 세포골격 역학을 연구할 수 있습니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(나트륨염)(DOPG)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>840475</td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850375</td> 클<td>로로포름</td></tr><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(캡 비오티닐)(나트륨염)(18:1 비오티닐 캡 PE)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>870273</td><td> 클로로포름</td></tr><tr><td>1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(나트륨염)(DPPG)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>840455</td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850355</td> 클<td>로로포름</td></tr><tr><td>96웰 평바닥 마이크로플레이트(SensoPlate)액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>틴(알파-액틴 골격근, 토끼)</td><td>HYPERMOL</td><td>8101-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto488-Actin (알파-액틴 골격근, 토끼)</td> <td>HYPERMOL</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto655-DOPE</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655-16</td><td>분말</td></tr><tr><td>목욕 초음파 처리기</td><td>Branson&nbsp;</td><td>1510R-MTH</td><td>브랜소닉 초음파 세척기</td></tr><tr><td>비오틴-액틴(알파-액틴 골격근, 토끼)</td> <td>HYPERMOL</td><td>8109-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마 알드리치</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>엡펜도르프</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>엡펜도르프</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 알드리치</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤(양)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>700000</td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>데칸</td><td>TCI Deutschland GmbH</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>Fascin(인간, 재조합)</td><td>Cytoskeleton Inc(Tebubio GmbH)</td><td>CS-FSC01-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll70</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2878</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol(OptiPrep)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>LSM800 공초점 레이저 주사 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40&thinsp; &시간; &thinsp;/1.2 침수 대물렌즈. 다이오드 펌핑 고체 레이저: 488&thinsp; NM 및 640&Thinsp; nm.</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Myosin II (토끼 골격근)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>MY02-A</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>삼투압계</td><td>Fiske Associates</td><td></td><td>Fiske Micro-Osmometer 모델 120</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One</td><td>&nbsp; 글로벌</td><td>07-000-109</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(guv) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

In vitro Reconstitution of Cytoskeletal Networks inside Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)

첫 번째 단계로, 변형된 역 에멀젼 접근법에 따라 멤브레인 상 분리가 있는 GUV가 생성되었습니다(그림 1A). 그 결과 높은 수율의 GUV가 생성되며, 이는 Ld 도메인과 L d 도메인과 라벨링되지 않은 Lo 도메인에 해당하는 어두운 영역의 Atto 655-DOPE 라벨로 표현되는 바와 같이 Ld 및 Lo 도메인으로 혼합된 멤브레인을 나타냅니다(그림 1B). 이 방법은 고온에서 5-30μm(그림 1C) 범위의 위상 분리 GUV를 생성합니다(모든 단계는 37°C에서 수행되고 RT에서 이미징됨). 또한, 원심분리 속도를 조정하여 GUV 내에 원래 성분 지질이 통합되도록 하고 과도한 과잉 증식을 방지했습니다.
또한, 현재 프로토콜에 설명된 에멀젼 방법을 사용하여 생체 분자의 성공적인 캡슐화를 입증하기 위해 FtsZ와 액틴 네트워크를 개별 실험에서 재구성했습니다. FtsZ 네트워크는 2.5mM GTP 및 50g/L Ficoll70(그림 2 참조)이 존재할 때 막 표적화 서열(MTS)을 통해 Ld 도메인에 우선적으로 결합하는 필라멘트로 나타나는 GUV 내부로 요약됩니다. 네트워크는 캡슐화 단계 후 약 1시간 후에 관찰되었습니다. 그러나 액토미오신 네트워크는 GUV 내에서 재구성 후 얇은 다발(FtsZ의 두꺼운 네트워크와 대조적으로)로 나타납니다(그림 3). 비오틴화된 지질은 액토미오신 네트워크가 GUV의 막에 결합하는 데 중요한 역할을 한다는 점에 유의해야 합니다. 비오틴화된 지질이 없으면 액토미오신 다발은 곡선 구성을 채택할 수 없으며 긴 다발의 얽힌 그물망으로 멤브레인에 부착되는 대신 내강에서 곧고 짧고 뻣뻣한 다발로 남아 있습니다(그림 4).
변형된 에멀젼 프로토콜에서는 앞서 언급한 바와 같이 상분리된 GUV를 얻기 위해 원심분리 속도를 조정합니다. 실제로, 액토마이신 네트워크(15분 동안 600 x g )를 포함하는 샘플의 더 높은 원심분리 속도는 소포가 생산 웰 내부에서 조직과 같은 구성으로 응집되는 결과를 낳습니다. 따라서 액토미오신 네트워크의 모든 표준 재구성 실험에서 최적의 원심분리 속도를 200 x g 로 설정하여 응집되지 않은 GUV를 얻었습니다(그림 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig1.jpg"> 
그림 1: 이중 에멀젼 전달 방법을 사용하는 상 분리 GUV의 원팟 생성. (A) 이중 에멀젼 전달을 통한 상 분리 소포의 원포트 생산의 핵심 단계에 대한 실험 계획. (B) A. 스케일 바에 설명된 방법에 따라 생성된 결과 GUV의 컨포칼 Z-투영 이미지는 50μm입니다. (C) 직경에 따라 생성된 위상 분리된 GUV의 분율이 있는 막대 그래프. 수행된 실험 n = 3, 실험당 분석된 총 GUV 수 = 100. 평균값으로 표시된 데이터, 개별 데이터 포인트는 세 가지 독립적인 실험입니다. 오차 막대는 세 가지 실험의 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig2.jpg"> 
그림 2: 캡슐화된 FtsZ 네트워크가 있는 위상 분리된 소포. (A) FtsZ 네트워크를 포함하는 위상 분리 GUV의 완전히 획득된 z-스택에서 수행된 컨포칼 3D 투영 이미지. (B) 소포의 위쪽 절반에서만 수행된 컨포칼 Z-투영 이미지. GUV 표면에 걸쳐 도메인이 이질적으로 형성되기 때문에 획득된 공초점 절편의 3D 재구성은 소포의 상단과 하단 영역에서 지질 도메인이 겹치는 것을 보여줍니다. 중복을 방지하고 도메인의 시각적 검사를 용이하게 하기 위해 획득한 z-스택의 아래쪽 절반이 파일에서 제거됩니다. 결과 상단 절반은 표준 편차를 통한 3D 투영에 사용됩니다. 눈금 막대는 모두 20μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig3.jpg"> 
그림 3: 캡슐화된 액토마이신 네트워크가 있는 위상 분리된 소포. (A) 소포 생산 후 웰의 축소 보기가 있는 전체 획득 스택의 공초점 Z 투영 이미지. 얻어진 소포의 높은 수율은 소포 내의 다양한 액토마이신 구조를 연구할 수 있게 합니다. 스케일 바는 50μm입니다. (B) 소포의 위쪽 절반에서 수행되는 컨포칼 Z 투영 이미지. 지질 영역의 시각적 분석을 용이하게 하기 위해 이미지 슬라이스의 위쪽 절반만 3D 투영을 수행하는 데 사용됩니다. 눈금 막대는 10μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig4.jpg"> 
그림 4: 상분리된 소포 내부의 막결합 액토미오신 네트워크 생성을 위한 비오틴화된 지질의 중요성. 연결되지 않은 액토미오신 네트워크가 있는 위상 분리된 소포를 묘사하는 컨포칼 3D 투영. 비오틴화된 지질이 혼합물에 통합되지 않으면 액토미오신 구조가 내강에서 형성되고 소포의 내부 소엽에서 곡선 구성을 획득하지 않습니다(오른쪽 패널, Atto488로 표지된 액틴). 눈금 막대는 50μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig5.jpg"> 
그림 5: 에멀젼 전달을 통한 상 분리 소포 생산에 대한 원심분리 속도의 효과. 15분 동안 600 x g의 원심분리력을 사용하여 생성된 GUV 샘플을 보여주는 컨포칼 2D 이미지. 최적화된 200 x g보다 빠른 원심분리 속도는 웰 내부에서 소포를 조직과 같은 구성으로 응집시킵니다. 눈금 막대는 100μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

Biomimetic lipid membranes in the form of giant unilamellar vesicles (GUVs) are commonly used to mimic cellular membrane behavior because of the ease of ...

in-vitro-reconstitution-cytoskeletal-networks-inside-phase-separated

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

고도로 채워진 마이크로미터 크기의 구성 요소를 포함하는 거대한 소포는 유용한 세포 모델입니다. 유중수(water-in-oil) 에멀젼 원심분리 방법은 캡슐화된 물질로 거대한 소포를 준비하기 위한 간단하고 강력한 도구입니다.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

단계 구분 된 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs)에 대 한 실험은 자주 생리 솔루션 조건 게을리. 이 작품 횡단 막 솔루션 비대칭 및 온도 기능으로 충전된 multicomponent GUVs에서 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼의 효과 연구에 접근을 제공 합니다.

형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

배우세요 상분리된 거대 단일층 소포 내부에서 세포골격 네트워크를 재구성하는 방법을. FtsZ와 액틴 번들을 캡슐화하여 합성 세포에서 단백질 기능을 유지하고 세포골격 역학을 연구할 수 있습니다.

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

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