시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

우리의 연구는 천연 세포막의 구조와 거동을 밀접하게 모방하는 막을 설계하는 데 중점을 두고 최소한의 합성 세포가 주요 생물학적 기능을 복제할 수 있는지 여부를 탐구합니다.

상 분리 소포를 만들고 이러한 마이크로캐리어를 다양한 응용 분야에 사용하기 위해 다양한 기술이 사용됩니다. 예를 들어 기술은 이중층 cDICE 및 전기 주조입니다. 한 가지 주요 과제는 막 소포에서 상 분리를 생성하면서 단백질 기능을 유지하는 것입니다. 온도를 높이면 단백질과 기타 생체 분자가 불안정해질 수 있습니다.

[해설자] 시작하려면 비오티닐화 및 비비오티닐화 지질 혼합물 바이알을 얻으십시오. 각 32밀리몰 지질 혼합물 50마이크로리터를 클로로포름에 녹입니다. 그런 다음 질소 가스 흐름 하에서 약 15분 동안 두 개의 유리 바이알에 담아 건조시킵니다. 유리 바이알을 건조기에 넣습니다. 잔류 클로로포름을 제거하기 위해 약 30분 동안 진공 상태에서 보관하십시오. 이제 건조된 지질 필름을 20마이크로리터의 데칸과 500마이크로리터의 미네랄 오일의 혼합물에 동일한 바이알에 분산시켜 최종 지질 농도 3.2밀리몰을 달성합니다. 목욕 초음파 처리기를 사용하여 섭씨 약 50도에서 30분 동안 두 혼합물을 초음파 처리합니다. 그런 다음 지질과 오일 혼합물을 두 개의 튜브로 옮깁니다. 혼합물이 배양되는 동안 단백질을 위한 내부 캡슐화 혼합물을 준비합니다. FtsZ 단백질 혼합물을 준비하려면 나열된 시약을 튜브에 10마이크로리터의 최종 부피에 첨가합니다. 사용할 때까지 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 액틴 다발의 캡슐화를 위해 먼저 물에 86% G-액틴, 10% ATTO 488 액틴 및 4% 비오틴화 액틴을 함유한 액틴 마스터 믹스 10마이크로리터를 준비합니다. 혼합물을 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 사용하기 직전에 요오딕사놀, 물, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, 10x 액틴 중합 완충액, A-Mix, 파신 및 ATP를 순서대로 첨가하여 최종 액틴 용액을 준비합니다. 잘 섞고 캡슐화를 위해 5마이크로리터를 사용합니다. FtsZ를 캡슐화하려면 500마이크로리터의 FtsZ 반응 완충액을 1.5밀리리터 플라스틱 튜브에 피펫팅합니다. 200마이크로리터의 지질과 오일 혼합물을 부드럽게 첨가하여 오일-물 계면을 형성합니다. 두 번째 튜브에 200마이크로리터의 지질과 오일 혼합물을 추가합니다. 이 튜브를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 5마이크로리터의 FtsZ 단백질 혼합물을 배양된 지질 및 오일 튜브에 피펫팅하여 물방울로 가라앉도록 합니다. 용액이 탁해질 때까지 튜브를 5-6번 부드럽게 두드려 에멀젼을 형성합니다. 이전에 준비한 유수계면 위에 이 에멀젼을 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 6,000g으로 원심분리합니다. 샘플을 실온으로 30분 동안 식힙니다. 이제 피펫을 사용하여 상단 오일층을 부드럽게 제거하고 이미징을 위해 100-200마이크로리터의 용액을 남깁니다. 피펫 팁을 비스듬히 자릅니다. 튜브 바닥에서 50-100마이크로리터의 GUV 용액을 회수하는 데 사용합니다. 액틴을 96웰 플레이트에 직접 캡슐화하려면 198마이크로리터의 2몰 포도당과 802마이크로리터의 물을 결합하여 내부 액틴 혼합물의 삼투압과 일치하는 외부 포도당 용액을 준비합니다. 100리터의 리터당 10그램 BSA를 웰에 추가하여 96웰 플레이트의 웰을 부동태화합니다. 10-15분 배양 후, 100마이크로리터의 외부 용액으로 웰을 5회 세척합니다. 최종 세척 100마이크로리터를 남겨 둡니다. 이제 피펫을 측벽에 올려 50마이크로리터의 지질과 오일 혼합물을 우물에 부드럽게 추가하여 외부 용액 위에 올바른 층을 형성합니다. 별도의 튜브에 오일에 100마이크로리터의 지질을 넣고 배양합니다. 배양된 지질 및 오일 튜브에 2.5마이크로리터의 최종 액틴 용액을 첨가하여 물방울로 가라앉도록 합니다. 혼합물이 탁해질 때까지 튜브 바닥을 10-20번 부드럽게 두드립니다. 인터페이스를 깨뜨리지 않고 우물의 오일 단층 중앙에 에멀젼을 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 섭씨 37도에서 20분 동안 200g으로 원심분리합니다. 이미징하기 전에 플레이트를 실온으로 30분 동안 식히십시오. 막이 액체 무질서하고 액체 질서정연한 도메인으로 혼합되지 않고 5에서 30마이크로미터 사이의 높은 수율 소포를 가진 거대한 단층 소포 또는 GUV가 얻어졌습니다. FtsZ 네트워크는 GUV 내에서 요약되었고 GTP 및 Ficoll 70의 존재 하에서 액체 무질서한 막 도메인에 우선적으로 국한되었습니다. 액틴 네트워크는 재구성될 때 막에 부착되는 얇은 다발로 나타나 희박한 거미줄과 같은 구조를 형성했습니다. 비오틴화된 지질이 없으면 액틴 다발은 막에 부착되지 않고 대신 소포 내강 내에서 단단하고 직선으로 유지되었습니다. 더 높은 원심분리 조건에서 액틴 미오신을 함유한 소포는 생산 우물에서 채워진 조직과 같은 구조로 응집되었습니다.