과분극 ^13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

우리는 고급 과분극 NMR 기술을 사용하여 실시간 혈청 대사를 측정하는 비침습적 방법을 개발했습니다. 우리의 목표는 다양한 생물학 연구 응용 프로그램을 위한 접근 가능한 도구를 만드는 것입니다. 혈청 대사를 위한 여러 과분극 NMR 시스템이 보고되었습니다. 그러나 광범위한 연구 구현을 위한 표준화되고 재현 가능한 프로토콜은 지금까지 사용할 수 없었습니다.

우리의 프로토콜은 상용 사용 가능한 구성 요소를 사용하여 접근성을 향상시킵니다. 또한 광범위한 적응을 위한 시스템 혼합 이점과 반복 측정 기능을 포함하여 포괄적인 검증을 제공합니다. 우리의 결과를 통해 산만함 없이 살아있는 세포의 동적 대사 변화를 실시간으로 추적할 수 있습니다. 이는 다양한 대사 프로브 응용 분야에서 장기 약물 연구에 대한 새로운 가능성을 열어줍니다.

우리의 접근 방식에는 prob 옵션 및 자동화 요구 사항을 포함한 한계가 있습니다. 이러한 문제를 해결하면 세포 대사 측정 기술이 확립되고 향후 우리 연구실의 DNP 연구 노력이 풍부해질 것입니다.

[해설자] 시작하려면 0.25% 부피 대 부피 트립신 EDTA 용액 2밀리리터를 10cm 접시에 추가합니다. 접시를 부드럽게 기울여 전체 표면이 덮이도록 합니다. 그런 다음 과잉 트립신 에틸렌디아민테트라틴산 용액을 흡인합니다. 접시를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 넣고 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 접시에 배양 배지 10ml를 추가합니다. 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫을 사용하여 표면에서 세포를 분리하고 전체 세포 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 모으십시오. 이제 약 10마이크로리터의 세포 현탁액을 가져다가 세포 계수기에 넣어 세포 수를 결정합니다. 측정된 수가 약 1,000만 개의 세포 수율을 확인하는지 확인하거나 필요에 따라 조정하십시오. 나머지 세포 현탁액을 120 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 흡인하여 버립니다. 생성된 세포 펠릿을 2중량 대 부피 알지네이트 용액 4밀리리터에 재현탁하고 기포 형성을 최소화하기 위해 천천히 피펫팅합니다. 이제 50밀리리터 원심분리기 튜브에 50밀리리터 염화칼슘 용액 10밀리리터를 추가합니다. 염화칼슘 용액이 들어 있는 원심분리기 튜브의 캡에 주사기를 고정합니다. 300마이크로리터의 세포 알지네이트 혼합물을 3게이지 10mm 바늘이 장착된 0.5밀리리터 주사기에 끌어당깁니다. 그런 다음 주사기를 캡에 고정한 상태에서 원심분리기 튜브를 단단히 닫고 어셈블리를 원심분리기에 넣어 200 x g으로 5분 동안 부드럽게 회전시킵니다. 원심분리 후 상청액을 제거하고 생성된 겔을 배양 배지에 재현탁합니다. 다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 캡슐화된 젤을 NMR 튜브로 옮기고 스펀지 고정 장치를 삽입하여 단단히 밀봉되도록 합니다. 섭씨 37도 수조에서 5% 부피 대 부피 중 산화수소가 포함된 중간 저장소를 예열합니다. 조건을 안정시키기 위해 시간당 약 500마이크로리터의 속도로 순환을 시작하십시오. 계속하기 전에 설정을 검사하여 누출이 없는지 확인하십시오. 25밀리몰 OX063이 도핑된 14.2몰 농도의 탄소 13-표지 피루브산 18마이크로리터를 샘플 바이알에 첨가합니다. 바이알을 동적 핵 분극 편광판 시스템의 유체 경로에 연결합니다. 그런 다음 연결된 바이알을 동적 핵 편광판의 보어 장치에 삽입합니다. 188-22밀리와트의 전력으로 약 60기가헤르츠의 마이크로파 조사를 80분에서 80분 동안 적용합니다. 동적 핵 분극 시스템에 통합된 고체 핵 자기 공명 분광기를 사용하여 탄소 13 신호 강도를 모니터링합니다. 시스템 제어 소프트웨어를 사용하여 5분마다 신호 데이터를 기록합니다. 이제 생물학적 온도로 예열된 3.2밀리리터의 용해 완충액에 분극된 샘플을 빠르게 용해시킵니다. 준비된 샘플을 NMR 튜브에 넣고 튜브를 분광계에 삽입합니다. NMR 콘솔에서 자동화된 절차를 시작하여 최적의 스펙트럼 분해능 및 신호 안정성을 보장하기 위해 샘플을 제자리에 있는 상태에서 잠금, 튜닝, 매칭 및 시밍을 수행합니다. 13-CPD와 같은 설정을 사용하여 양성자 디커플링이 활성화된 탄소 13 펄스 획득 시퀀스를 로드합니다. P1로 표시된 1마이크로초 펄스로 플립 각도를 90도로 설정합니다. 다음으로, 획득 시간을 1.376초로, 스펙트럼 폭을 23,663헤르츠로, 획득 지점(TD)을 65,536으로 정의합니다. 완화 지연 D1을 0초로 설정합니다. 의사 2차원 모드에서 150개의 순차 스펙트럼을 수집하기 위해 TD1에 150 시간 증분을 할당하고 수신기 게인을 약 1과 같은 낮은 값으로 조정하여 과분극 샘플로 인한 신호 포화를 방지합니다. 이제 흡입 튜브를 통해 과분극 용액을 주입하기 전에 연동 펌프를 중지하여 매체의 순환을 일시적으로 중지합니다. 과분극 기판을 용해하기 약 10초 전에 스펙트럼 수집을 시작하여 검출 부위에 도착할 때 신호 캡처를 보장합니다. 용액이 동적 핵 편광 편광판을 빠져나오면 1밀리리터를 주사기에 넣습니다. 바이오리액터 입구의 3방향 밸브를 위치 B로 전환하여 과분극 용액을 NMR 튜브로 향하게 합니다. 주입이 완료되면 밸브를 다시 위치 A로 전환하여 매체 순환을 재개하고 역류를 방지합니다. 마지막으로, 획득 소프트웨어에서 자유 유도 감쇠 신호의 증가를 확인한 후 주입이 성공했는지 확인합니다. NMR 측정을 위해 옮기기 전에 최종 용액이 308에서 313켈빈 사이의 온도와 약 7켈빈의 pH에 도달하는지 확인하십시오. 반복적인 비파괴 측정의 타당성을 평가하기 위해 동일한 SCCVII 세포 캡슐화 샘플의 과분극 탄소 13 NMR 스펙트럼을 1.5시간 간격으로 획득했습니다. 첫 번째 NMR 측정은 젖산 신호가 현저하게 증가한 것으로 나타났으며, 이는 활성 피루브산에서 젖산으로의 대사 전환을 나타냅니다. 1.5시간 간격으로 후속 측정에서 젖산 신호 강도가 점진적으로 감소한 것으로 나타났으며, 이는 시간이 지남에 따라 대사 활동이 감소했음을 나타냅니다. HeLa 세포에서 초기 측정은 명확하게 식별할 수 있는 신호 피크와 함께 성공적인 피루브산에서 젖산으로의 전환을 확인했습니다. T2 이완으로 인해 신호가 점진적으로 감소했지만 신호 대 잡음비는 60초 획득 내내 적절한 상태로 유지되었으며, 이는 현재 프로토콜이 광범위하게 적용 가능하며 다양한 세포 유형에서 실시간 대사 프로파일링을 위한 다목적 도구 역할을 할 수 있음을 시사합니다.