Name: 과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 학습하세요 과분극 ¹³C NMR 분광법을 활용한 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사 측정 방법을. 이 프로토콜은 대사 연구와 약물 스크리닝을 위한 재현성 있는 도구를 제공합니다.

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<ol><li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%26gt%3B10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of &gt;10,000 times in liquid-state NMR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+magnetic+resonance+as+a+sensitive+detector+of+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function.</a> Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Balzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+Instrumentation+for+Real-time+Enzymatic+Reaction+Rate+Measurements+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR.</a> J Vis Exp. (108), e53548(2016).</li>
<li>Liu, M., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+measurements+of+nonpermeating+compounds+in+live+cells+using+hyperpolarized+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR.</a> Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).</li>
<li>Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+approach+for+real-time+exploration+of+pathway+versatility%3A+substrate+mixtures+in+nonengineered+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast.</a> Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Rao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate-to-%5B1-13C%5Dlactate+conversion+is+rate-limited+by+monocarboxylate+transporter-1+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).</li>
<li>Mathiassen, T. B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+for+longitudinal+in-cell+metabolism+using+a+mobile+3D+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Open%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system.</a> J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).</li>
<li>Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+reveals+pathway+regulation+in+Lactococcus+lactis+and+metabolic+similarities+and+differences+across+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life.</a> Molecules. 29 (17), 4133(2024).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacteria-specific+metabolism+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate.</a> ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).</li>
<li>Park, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+sodium+%5B1-13C%5D-glycerate+as+a+probe+for+assessing+glycolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo.</a> J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+carbohydrate+metabolism+using+hyperpolarized+13C-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules.</a> NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).</li>
<li>Bohndiek, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5D-ascorbic+and+dehydroascorbic+acid%3A+vitamin+C+as+a+probe+for+imaging+redox+status+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo.</a> J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+insight+into+in+vivo+redox+status+utilizing+hyperpolarized+%5B1-13C%5D+N-acetyl+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine.</a> Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).</li>
<li>Düwel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+pH+in+vivo+using+hyperpolarized+13C-labelled+zymonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid.</a> Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).</li>
<li>Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assessment+of+intracellular+and+extracellular+pH+using+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dalanine+ethyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester.</a> Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).</li>
<li>Eills, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+hyperpolarization+in+modern+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance.</a> Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).</li>
<li>Keshari, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+spectroscopy+and+an+NMR-compatible+bioreactor+system+for+the+investigation+of+real-time+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism.</a> Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+hyperpolarized+lactate+production+and+efflux+as+a+biomarker+of+tumor+aggressiveness+in+an+MR+compatible+3D+cell+culture+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor.</a> NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).</li>
<li>Mangas-Florencio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DIY+bioreactor+for+in+situ+metabolic+tracking+in+3D+cell+models+via+hyperpolarized+13C+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy.</a> Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).</li>
<li>Hill, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+free+approach+to+kinetic+analysis+of+real-time+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+spectroscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data.</a> PLoS One. 8 (9), e71996(2013).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MR+spectroscopic+imaging+with+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate+detects+early+response+to+radiotherapy+in+SCC+tumors+and+HT-29+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors.</a> Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).</li>
<li>Sengupta, D., Pratx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolic+heterogeneity+in+cancer%3A+from+PET+to+hyperpolarized+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI.</a> Mol Cancer. 15, 43(2016).</li>
<li>Read, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+alginate+hydrogels+for+radiobiological+and+metabolic+studies+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).</li>
<li>Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+NMR+probes+for+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized NMR probes for biological assays.</a> Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).</li>
<li>Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+nuclear+magnetic+resonance+molecular+probes+for+hyperpolarized+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging.</a> Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).</li>
<li>Milani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+magnetic+tunnel+to+shelter+hyperpolarized+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids.</a> Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>[1-13C] 피루브산</td><td>케임브리지 Isot ope Laboratories, Inc.</td><td>CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>3D 프린터</td><td>엘레구</td><td>토성 2</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>나칼라이 테스크, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>펌프용 외부 순환 키트</td><td>하나로</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>깁코</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>플랜지리스 피팅 세트</td><td>GL 사이언스 주식회사</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>코어가 있는 유리 모세관</td><td>나리시게</td><td>GDC-1.5</td><td>내경 ~0.9mm, 길이 90mm</td></tr><tr><td>마그네틱 순환 펌프</td><td>하나로</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>메스트레노바</td><td>메스트렐랩 연구</td><td></td><td>NMR 스펙트럼 처리 및 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>내 샷 주사기</td><td>니프로 코퍼레이션</td><td>8277</td><td>0.5mL/100U, 30G x 10mm, 140개</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&nbsp; 옥스포드 인스트루먼트 주식회사 &nbsp; 및 Polarize IVS Co. Ltd.&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 튜브</td><td>하나로</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>나칼라이 테스크, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>연동 바이오 미니 펌프</td><td>아토</td><td>1221200</td><td>안정적인 매체 흐름을 위한 고정밀, 넓은 유량 유형</td></tr><tr><td>수지</td><td>시라야 테크</td><td>스모키 블랙</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 미디엄</td><td>나칼라이 테스크, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>실리콘/PTFE 바이알 격막</td><td>GL 사이언스 주식회사</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>알긴산나트륨 80-120</td><td>후지필름 와코 퓨어 케미칼 주식회사</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>SPINit 소프트웨어</td><td>RS2D</td><td></td><td>DNP 편광판의 NMR 소프트웨어</td></tr><tr><td>스펀지</td><td>-</td><td>-</td><td>젤 안정화를 위해 크기에 맞게 절단된 시중에서 판매되는 스펀지</td></tr><tr><td>3방향 마개쇠</td><td>하나로</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>탑스핀</td><td>브루커</td><td></td><td>NMR 데이터 수집 및 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.25%)</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>UV 경화성 수지</td><td>본딕</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>하나로</td><td>1-5832-41</td><td>열 로봇 TR 시리즈 TR-1&alpha; 37 &deg 유지용; C 온도</td></tr><tr><td>Wilmad 스크류 캡 NMR 튜브</td><td>시그마</td><td>Z271977</td><td>주파수 400MHz, 직경 10mm, L 178mm.</td></tr></tbody></table>

과분극 13cnmr을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

본 연구에서는 살아있는 세포의 피루브산 대사를 실시간으로 측정하기 위해 제작된 시스템을 과분극 13CNMR 분광법과 결합했습니다. 1D 13CNMR 스펙트럼에서 검출된 주요 신호는 피루브산(약 171ppm) 및 젖산(약 183ppm)21에 해당하여 생리학적 조건에서 피루브산의 젖산으로의 대사 전환을 평가할 수 있었습니다(그림 4).
스펙트럼 품질 및 신호 역학 과분극 MRI 연구에 자주 사용되는 마우스 편평 세포 암종기인 SCCVII 세포를 사용하여 동일한 샘플에서 반복 측정한 대표적인 결과가 그림 5에 나와 있습니다. 첫 번째 측정에서는 젖산 신호가 뚜렷하게 증가하여 활발한 대사 전환을 나타냈습니다. 그러나 1.5시간 간격으로 실시한 후속 측정에서는 대사 활동이 점진적으로 감소하는 것으로 나타났습니다. 이러한 시간 의존적 감소는 초기 피루브산 주입으로 인한 생물학적 스트레스 또는 적응을 반영하는 것으로 보입니다. 특히, 과분극 MRI 및 EPRI를 사용한 생체 내에서 유사한 일시적인 대사 조절이 보고되었는데, 여기서 피루브산 투여 후 종양 산소화가 일시적으로 감소했다22. 이러한 결과는 이러한 측정의 반복성이 동적 대사 변화를 비파괴적으로 추적할 수 있음을 보여주며, 이는 파괴적인 방법으로는 달성하기 어려운 이점입니다23.
이 프로토콜이 다른 세포 유형에 적용할 수 있는지 평가하기 위해 널리 사용되는 인간 암 세포주인 HeLa 세포를 사용하여 추가 측정을 수행했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 HeLa 세포는 또한 명확한 피루브산에서 젖산으로의 변환을 보여주었습니다. T1 이완으로 인해 신호 강도가 점차 감소했지만, 신호 대 잡음비는 60초 획득 기간 동안 충분하게 유지되었습니다. 이러한 결과는 현재 프로토콜이 광범위하게 적용할 수 있으며 다양한 세포 유형에서 실시간 대사 프로파일링을 위한 다목적 도구 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
빠른 신호 감쇠는 DNP 기반 NMR의 고유한 한계이지만, 당사의 현장 혼합 시스템은 용해와 측정 사이의 지연을 최소화하여 검출 감도를 향상시킵니다. 겔 매트릭스 조성 최적화와 같은 추가 개선은 이 방법의 적용 가능성을 더 넓은 범위의 생물학적 시스템으로 확장할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
그림 1: 세포 배양에서 과분극 NMR 측정까지의 전체 워크플로우에 대한 개략도. 이 공정은 세포 배양(~2주)으로 시작하여 안정적인 측정을 위해 세포를 캡슐화하기 위한 알긴산 겔 준비(~60분)로 이어집니다. 다음으로, DNP 편광자 시스템(~60분)을 사용하여 과분극을 수행하고, 400MHz NMR 분광계(~5분)를 사용하여 NMR 측정을 수행합니다. 오른쪽 사진은 이 워크플로우에 사용된 해당 기기를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
그림 2: 과분극 NMR 측정을 위한 바이오리액터 설정. (A) 생물반응기 설정의 개략도. 배양 배지는 주입구 A를 통해 NMR 튜브로 도입된 후 폐기물로 유도됩니다. 살아있는 세포를 포함하는 알긴산 비드를 NMR 튜브 내부에 배치합니다. 과분극 NMR 측정 중에 과분극 프로브는 과분극 프로브 유입구로 표시된 입구 B를 통해 주입됩니다. (B) 입구 및 출구 튜브에 명확하게 레이블이 지정된 전체 생물 반응기 설정의 사진. (C) 입구 A(중간 관류) 및 입구 B(과분극 프로브 주입)를 보여주는 입구 튜빙 스위치의 클로즈업 보기. (D) CAD 설계 및 (E) NMR 튜브 내부에 배치된 3D 프린팅 스폰지 고정 부품의 대표 사진. 이 구성 요소에는 안내를 위한 구멍, 과분극 기판 용액을 전달하는 유리 모세관, 스펀지를 담을 수 있는 플랫폼이 포함되어 있습니다. 구성 요소 자체가 NMR 튜브의 내벽에 단단히 맞지 않습니다. (F) 대신 스폰지를 삽입하여 틈을 채웁니다. 이 구조는 구성 요소를 안정화하고 폐기물 매체가 스펀지를 통해 위쪽으로 흐르도록 하여 추가 배출 구멍이 필요하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
그림 3: 알긴산 겔 제제. (A) 알긴산 겔볼 형성 장치의 개략도 및 (B) 사진. 왼쪽 이미지는 수정된 뚜껑에 주사기가 고정된 원심분리기 튜브를 포함한 전체 설정을 보여줍니다. 오른쪽 상단 이미지는 주사기 팁을 위한 작은 구멍이 있는 뚜껑을 보여주고, 오른쪽 하단 이미지는 안정적인 주사기 위치를 위해 사각형 구멍이 있는 뚜껑을 보여줍니다. 원심분리기 튜브에는 10mL의 염화칼슘 용액이 미리 채워져 있어 주사기 끝에서 나오는 알긴산 용액이 겔화되어 알긴산 겔 볼을 형성할 수 있습니다. (C) 알긴산 겔 볼의 형태를 보여주는 대표적인 현미경 이미지. (D) HeLa 세포를 포함하는 알긴산 겔 볼의 형태를 보여주는 대표적인 현미경 이미지. 스케일 바 = 200μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
그림 4: NMR 측정 및 과분극을 위한 준비 단계의 개략도. ~60분 DNP 빌드업 프로세스 동안 NMR 설정은 지연을 최소화하기 위해 병렬로 수행됩니다. 준비에는 NMR 튜브에 알긴산 비드 로딩 후 1H잠금 조정, shimming 및 프로브 튜닝이 포함되어 시스템이 즉시 측정할 준비가 되었는지 확인합니다. 용해 및 현장 혼합 후 시간 분해 13C NMR 분광법은 투명한 피루브산 및 젖산 피크를 나타냅니다. 약 171ppm, 179ppm 및 183ppm에서 관찰된 피크는 각각 피루브산, 피루브산 수화물 및 젖산에 해당합니다. 알기네이트 겔에 캡슐화된 약 4 ×10 7개의 HeLa 세포가 NMR 측정에 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
그림 5: 반복 측정에서 피루브산 및 젖산 신호의 시간 분해 검출. 동일한 SCCVII 세포-캡슐화된 샘플의 과분극된 13CNMR 스펙트럼을 반복적인 비파괴 측정의 타당성을 평가하기 위해 1.5시간 간격으로 획득했습니다. 피루브산(열린 원) 및 젖산(채워진 원, 1000×로 조정됨) 최고 강도는 각 획득에 대해 시간 경과에 따라 표시됩니다. (A) 첫 번째 측정. (B) 1.5시간 후의 두 번째 측정은 젖산 생산의 현저한 감소를 보여줍니다. (C) 1.5시간 후 세 번째 측정에서 낮은 대사 활성이 지속되는 것을 확인했습니다. AUC(Area Under the Curve)를 기반으로 한 정량 분석에서 [젖산]/[피루브산] 비율이 0.00134(1차 측정)에서 0.00019(2차) 및 0.00027(3차)로 감소한 것으로 나타났습니다. 알기네이트 겔의 최종 세포 농도는 약 1.0 ×10 7 cells/mL (4 mL 내 4 × 107 cells)였습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
그림 6: HeLa 세포에서 피루브산이 젖산으로 전환됨. 피루브산 및 젖산의 시간 분해 과분극 13CNMR 신호를 살아있는 HeLa 세포에서 측정했습니다. 피루브산 신호 강도는 시간 0에서 최대값으로 정규화됩니다. 젖산 신호 강도는 가시성을 위해 103의 계수로 조정됩니다. AUC(Area Under the Curve)를 기반으로 한 정량 분석에서는 [젖산]/[피루브산] 비율이 0.00121로 나타났습니다. 알긴산 겔의 최종 세포 농도는 약 7.5 ×10 6 cells/mL (4 mL 내 3 × 107 cells)였습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
보충 그림 1. 생물반응기 시스템에 사용된 바이알 격막의 대표 이미지. (A) 사용하기 전에 실리콘/PTFE 격막(직경 9mm). (B) 구멍이 뚫린 구멍을 통해 삽입된 PEEK 튜브와 함께 실제로 사용되는 것과 동일한 격막. 격막 재료의 탄성으로 인해 튜브 주위를 다시 밀봉할 수 있어 과분극 기질 주입 중에 기밀 상태를 유지할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오</a>.
보충 그림 2: 외부 혼합 후 획득된 시간 분해 과분극 13CNMR 스펙트럼. 과분극 피루브산과 NMR 튜브 외부 세포의 외부 혼합 후 벤치탑 NMR 시스템을 사용하여 측정한 [1-13C] 피루브산 대사의 대표적인 시간 분해 스펙트럼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오</a>.
보충 파일 1: 원통형 홀더의 CAD 설계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오</a>.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

real-time-metabolic-detection-living-cells-using-hyperpolarized-13c

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

용해 동적 핵 분극(DNP)이 제공하는 감도 향상으로 NMR 및 MRI에 의해 실시간으로 대사 과정을 수행할 수 있습니다. 효소 반응 연구를 위해 설계된 전용 용출 DNP 설정의 특성과 성능에 대해 설명합니다.

NMR에 의해 실시간 효소 반응 속도 측정을위한 해산 동적 핵 편광 계측

다중 구획 동적 팬텀은 hyperpolarized magnet resonance agents를 사용하여 대사 연구를 위한 일부 관심 생물학을 시뮬레이션하는 데 사용됩니다.

과분극 자기 공명 에이전트의 연구 다중 구획 동적 단일 효소 팬텀의 사용

후속 샘플 용해를 통한 동적 핵 분극은 생물학적 시스템의 신진대사에 대한 실시간 연구를 가능하게 했습니다. 과분극[1-13C]피루브산은 in vitro에서 전립선 암종 세포주에서 젖산 탈수소효소 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

우리는 빠른 필드 사이클 이완을 사용하여 동적 핵 편광에 의해 과분극 13C 농축 화합물의 스핀 격자 이완 시간의 자기장 의존성을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 구체적으로, 우리는[1-13C] pyruvate로 이것을 입증했습니다, 그러나 프로토콜은 그밖 과극화한 기판으로 확장될 수 있었습니다.

과분극[1-13C] 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정

이 프로토콜은 캡슐화된 인간 세포를 최대 72시간 동안 생존할 수 있도록 유지하기 위한 NMR 생물반응기의 설정에 대해 설명하고, 이어서 시간 분해된 세포 내 NMR 데이터 수집 및 분석을 설명한다. 이 방법론은 세포 내 단백질-리간드 상호작용을 실시간으로 모니터링하기 위해 적용된다.

고세포 밀도 생물반응기를 이용한 실시간 정량적 세포내 NMR에 의한 인간 세포에서의 단백질-리간드 상호작용 모니터링

우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.

과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

형광 수명 이미징 (FLIM)는 이미지 환경과 특정 단백질과 생활 세포에있는 염료의 상호 작용에 핵심 기술로 부상하고있다. 형광 분자 rotors의 FLIM은 살아있는 세포의 점도 매핑 있습니다.

생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

우리는 전이성 질환의 조기 지표로 흑색증 세포 순환 감지하는 레이저 유도 초음파를 사용하여 플로우 cytometer을 개발했습니다.

Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가​​ 생성된다.

동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

학습하세요 과분극 ¹³C NMR 분광법을 활용한 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사 측정 방법을. 이 프로토콜은 대사 연구와 약물 스크리닝을 위한 재현성 있는 도구를 제공합니다.

과분극 ^13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

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