성숙한 종자에서 멸종 위기에 처한 약용 난초 Hemipilia cucullata 의 비공생 발아 및 잎 외개 식물 기반 재생

내 연구는 멸종 위기에 처한 난초에 대한 조직 배양 프로토콜을 최적화하여 이러한 귀중한 약용 식물의 보존, 대규모 번식 및 지속 가능한 활용을 강화하는 데 중점을 두고 있습니다. 주요 과제는 난초 종 전반에 걸쳐 일관된 발아 및 재생 속도를 달성하는 것인데, 각 종에는 종별 배지 최적화와 성장 조건의 정밀한 제어가 필요하기 때문입니다. 우리는 멸종 위기에 처한 여러 식물에 대한 효율적인 조직 배양 프로토콜을 개발하여 종 회복을 가능하게 하고 자연 서식지로의 재건을 지원했습니다.

Hemipilia cucullata 취급 번식, 복원 및 보존을 위한 효율적인 재현 가능한 조직 배양 시스템은 존재하지 않습니다. 육상 난초는 종종 분리 및 식별이 복잡한 특정 공생 곰팡이가 필요합니다. 공생 방법은 전파를 단순화하고 이러한 단계를 우회합니다.

우리의 실용적인 것은 높은 발아와 성숙한 상태에서 빠른 식물 재생을 가능하게 하여 곰팡이 의존성을 제거하고 Hemipilia cucullata 번식을 위한 더 빠르고 안정적인 접근 방식을 제공합니다. 시작하려면 캡슐을 비커에 넣으십시오. 헹구기 위해 비커에 세제 1-2방울을 추가합니다.

흐르는 수돗물에 캡슐을 5분 동안 씻습니다. 그런 다음 멸균 흡수지를 사용하여 캡슐에서 남은 표면 물을 제거합니다. 이제 캡슐을 75% 에탄올에 30초 동안 담그십시오.

캡슐을 약 5% 이용 가능한 염소를 함유한 20% 차아염소산나트륨 용액 50밀리리터에 담가 멸균합니다. 그런 다음 희석되지 않은 가정용 식기 세척 세제 2방울을 용액에 넣고 캡슐을 10-12분 동안 배양합니다. 캡슐을 멸균 증류수로 5번 헹구어 잔류 소독제를 제거합니다.

그런 다음 멸균 메스를 사용하여 캡슐의 정점과 꽃자루 끝에서 약 1mm를 제거합니다. 캡슐의 상단 끝에 작은 절개를 하여 씨앗을 노출시키고 멸균 페트리 접시에 모으십시오. 멸균 겸자를 사용하여 약 500 내지 600개의 종자를 준비된 배지가 들어 있는 각 배양 병에 고르게 분산시킵니다.

씨앗이 물을 흡수하고 액체 매체 바닥에 가라앉도록 하십시오. 배양물을 섭씨 25도로 유지하여 12시간의 명암주기와 초당 평방미터당 36마이크로몰의 광도를 유지합니다. 매주 종자 발아를 관찰하십시오.

눈에 보이는 형태학적 변화를 기록하고 문서화를 위해 문화 사진을 찍습니다. 싹 신장을 위해 눈에 띄는 검게 변하거나 완전히 황변되지 않는 크기가 1-2cm인 건강한 묘목을 선택하십시오. 멸균 및 냉각된 집게를 사용하여 8-12개의 묘목을 새로 준비된 신장 신장 배지가 들어 있는 각 병에 무균 상태로 옮깁니다.

각 병 안에 묘를 고르게 분배하십시오. 새싹 신장 5주 후, 잎 외식편 샘플링을 위해 완전히 발달된 새싹과 건강한 잎이 있는 묘목을 선택합니다. 멸균 메스를 사용하여 건강한 식물에서 완전히 팽창한 멸균 잎을 절제합니다.

정점 영역과 잎 가장자리를 제거합니다. 그런 다음 무균 상태에서 멸균 메스를 사용하여 각 잎을 약 0.5 x 0.5cm 세그먼트로 자릅니다. 10개의 잎 세그먼트를 ADAXIAL 표면이 위쪽을 향하도록 PLB 유도 매체에 놓습니다.

각 세그먼트가 매체에 단단히 닿는지 확인하십시오. 그런 다음 5주 동안 배양합니다. 마지막으로 성공적으로 유도된 PLB의 수를 평가하고 유도율을 백분율로 계산합니다.

평균 새싹 높이를 센티미터 단위로 기록하고 외식편당 형성된 새싹 수를 계산합니다. 액체 배지에서의 종자 발아는 약 60일에 종피에서 녹색 배아가 출현하는 것으로 눈에 띄게 특징지어졌으며, 이후 80-85일까지 구형 원구체를 형성했습니다. 72%의 가장 높은 발아율은 리터당 0.5mg의 NAA가 보충된 액체 배지에서 달성되었습니다.

리터당 0.5밀리그램의 벤질아데닌과 0.2밀리그램의 NAA를 함유한 B5 배지는 외식편당 평균 5.3개의 새로 형성된 원구균으로 가장 높은 원구체 증식률을 산출했습니다. 최적화된 성장 조절제 조합으로 B5 배지에서 배양된 Protocorms는 활발한 성장과 건강한 녹색 색소 침착을 보여 동일한 조건에서 MS 배지에서 성장한 Protocorms보다 성능이 뛰어났습니다. 평균 4개의 식물당 가장 많은 가지 수는 각 벤질아데닌과 NAA의 리터당 1밀리그램으로 관찰되었으며, NAA 단독이 리터당 0.5밀리그램으로 그 뒤를 이었습니다.

새싹 신장은 리터당 0.5mg의 벤질아데닌과 1리터당 1mg의 NAA의 조합으로 가장 향상되어 평균 묘목 높이가 4.8cm였습니다. 원박질 유사체의 가장 높은 유도율 44.3%는 리터당 0.2밀리그램의 NAA와 함께 리터당 3밀리그램의 벤질아데닌을 사용하여 달성되었습니다.