애기장대 의 수컷 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임의 라이브 이미징 특성화

저희 연구는 식물 감수분열을 탐구하며, 감수분열 진행 과정에서 상동 염색체 인식, 정렬, 쌍을 이끄는 분자 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 합니다. 도전 과제는 감수분열 프로필에서 염색체 이동을 시각화하는 것으로, 고해상도와 빠른 실시간 조직 영상으로 궤적을 추적해야 합니다. 먼저, 스페이서 한쪽 면의 보호막을 제거하고 유리 슬라이드 중앙에 놓으세요.

그 다음 두 번째 보호막을 제거하세요. 스페이서 중앙에 수돗물 8마이크로리터를 부으세요. 겸자를 사용해 주 줄기 중 하나에서 꽃차례를 뽑으세요.

꽃차례를 새 슬라이드에 올려놓고, 자와 함께 있는 스테레오 현미경 아래에 놓으세요. 길이 약 0.5밀리미터의 꽃봉오리를 선택하세요. 날카로운 바늘을 사용해 꽃받침과 꽃잎을 부드럽게 떼어 꽃약만 남기세요.

꽃받침과 꽃잎을 제거한 직후 조심스럽게 스페이서 공간의 물에 넣어 탈수를 방지하세요. 스페이서 공간 안에 여러 개의 다른 송이들을 넣으세요. 슬라이드를 커버 슬립으로 덮으면서도 공기 방울을 피하려면, 커버 슬립에 8마이크로리터의 물을 넣으세요.

그런 다음 스페이서 공동을 향한 물방울로 덮개 슬립을 조심스럽게 뒤집어 놓습니다. 다른 송이들이 총 16마이크로리터의 물에 담가야 하고, 커버 슬립이 스페이서에 잘 붙도록 하세요. 현미경을 488나노미터에서 이각시키고, 494나노미터에서 547나노미터 사이의 하이브리드 검출기로 검출합니다.

그 다음 밝은 필드 조명을 이용해 개골을 국소화하세요. 밝은 영역 채널을 사용하여 세포의 형태를 바탕으로 감수분열 단계를 결정합니다. 소프트웨어에서 표적을 시각화하고 RFP 신호를 세포의 감수분열 단계를 추가 지표로 사용하세요.

연속 획득을 수행하려면 시간 구간에서 시간 간격을 0으로 설정하세요. 그 다음 스팟 모듈을 사용해 자동으로 스팟을 추적하세요. 녹색 소스 채널을 선택하고 GFPCENH3 표시된 센트로미터의 XY 직경을 1마이크로미터로 설정하세요.

그 다음 제어 창 하단의 그래프를 이용해 신호 강도에 따라 검출 품질을 수정합니다. 자동 회귀 모션 추적 알고리즘을 사용해 중심체의 궤적을 추적하고 모든 궤적을 시각화하여 감수세포와 체세포를 쉽게 구분할 수 있습니다. 다음으로, 스팟 모듈을 사용해 선택한 핵의 시간에 따른 스팟을 추적하세요.

옵션 세그먼트를 선택하여 관심 영역을 정의하고, 관심 영역 하나만 선택하고 그 안에서 스팟 트래킹을 수행합니다. 원자핵이 3차원 모두와 시간에 걸쳐 적절히 포함된 관심 영역을 선택하세요. 계보 플롯에서는 소프트웨어의 3D 뷰어를 사용해 모든 궤적을 시각화하세요.

분석된 감수세포 외부의 궤적을 선택한 후 키보드의 삭제 키를 눌러 제거하세요. 편집 모드에서는 객체를 삭제하거나 추가하여 올바른 평면에 추가되도록 합니다. 편집 트랙 모드에서는 셀을 3D로 철저히 분석한 후 계보 그래프의 새로운 객체를 수동으로 연결하세요.

각 시간 단계마다 순간 속도를 계산하여 시간에 따른 이동 속도의 변화를 모니터링합니다. 회전각을 연속된 시간 단계 간 이동 방향 변화로 계산하여 궤적 패턴을 드러냅니다. 결과와 즉각적인 속도를 함께 저장하세요.

셀 트래커를 사용해 추적된 물체가 시작 위치에 대해 얼마나 이동하는지를 측정하여 탐색 행동을 나타냅니다. 각 트랙의 평균 속도를 계산하여 관찰 기간 동안의 이동 특성을 요약합니다. 트랙당 평균 회전 각도를 계산하여 이동, 방향성, 행동 패턴을 분석하고 결과를 저장합니다.

다음으로, 각 시간 단계별 중심체 크기를 계산하여 중심 신경체의 평균 위치 주변의 공간적 분산을 측정합니다. 중심체 크기의 시간에 따른 변화를 이용해 중심체 트랙 전반의 전역 일관성을 평가하고 결과를 저장하세요. 속도 교차 상관을 계산하여 서로 다른 추적 대상 간의 움직임 역학 간 관계를 분석하여 잠재적인 조정 행동을 드러냅니다.

그 다음 각 트랙의 평균 제곱 변위를 계산하여 주어진 시간 동안 중심 신경체가 이동한 평균 제곱 거리를 정량화합니다. 감수분열 중심체는 체세포 중심체에 비해 평균 속도가 109.35나노미터/초로 유의미하게 높았습니다. 감수분열 중심체는 체세포 중심체에 비해 더 넓은 범위와 더 높은 정규화 도달 비율을 보였습니다.

회전각 분포는 감수분열과 체세포 중심체에서 차이가 있었다. 감수분열 중심부분의 평균 제곱 변위는 시간이 지남에 따라 증가한 반면, 체세포 중심체는 대체로 정체성을 유지했습니다. 이 프로토콜은 애기대에서 감수분열 염색체 이동을 처음으로 정량화하여 접합 및 파키텐 단계에서 중심미의 극적인 역학을 밝혀냈습니다.

이 프로토콜은 감수분열 전기 동안 유전체 영역 이동을 연구할 수 있게 하며, 다른 식물 종에도 적용할 수 있습니다. 이 연구는 염색체 이동과 재조합 상호작용을 탐구하여 식물 생식세포 형성 과정에서 유전적 다양성을 유발하는 메커니즘에 대한 이해를 심화시킵니다.