질량분석법을 이용한 후생유전학적 프로파일링을 위한 임상 표본에서 히스톤 추출

우리의 연구 범위는 암 샘플의 후생유전학적 변화를 분석하고, 새로운 진단 및 예후 바이오마커를 발견하며, 치료의 잠재적 표적을 식별하는 것입니다. 임상 샘플의 주요 과제는 제한된 물질과 고정 유발 인공물입니다. 하지만 최적화된 워크플로우와 di 민감도 MS를 통해 단 1000개 세포에서 최대 50개의 히스톤 PTM을 정량할 수 있습니다.

우리는 질량분석이 임상 샘플 내 히스톤 PTM 변화를 정량화할 수 있음을 보여주며, 후생유전학적 메커니즘에 대한 통찰을 제공하고 바이오마커 발견과 정밀 후생유전치료에 필요한 약물 표적 식별을 가능하게 합니다. 우리 프로토콜은 다양한 임상 샘플에서 히스톤 PTM에 대한 견고하고 정량적이며 민감한 프로파일링의 필요성을 다룹니다. 질량분석법은 히스톤 PTM 분석에 이상적이며, 동일한 펩타이드에서 편향 없는 검출, 동시 프로파일링, 공존 분석을 제공하여 항체 기반 방법의 한계를 극복합니다.

시작하려면, 얼음 위에 신선한 냉동 조직을 녹이고 메스나 칼날로 약 20에서 30밀리그램 크기의 조직 조각을 잘라냅니다. 절단된 조직 샘플을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 가위를 사용해 조직을 작은 조각으로 잘게 썰어냅니다.

신선하게 준비한 핵 분리 완충제 1밀리리터에 지정된 프로테아제 억제제를 보충한 후 조직을 다시 다집니다. 샘플을 다운 균질기로 옮깁니다. 먼저 느슨한 공을 사용하고, 그 다음에 꽉 조인 공을 사용해 육안으로 보이지 않는 조각이 남지 않을 때까지 조직을 균질화합니다.

균질화된 샘플을 100마이크로미터 셀 체에 걸러 조직 이물질을 제거합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용해 필터링된 샘플을 격렬하게 위아래로 피펫하여 원형질막을 녹입니다. 샘플을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮기세요.

튜브를 벤치 위 원심분리기에 넣고 2,300G에서 4도 섭씨로 15분간 돌려 핵을 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 버린 후, 핵 펠릿을 50에서 100마이크로리터의 핵 격리 완충제에 재현탁시키고, 0.1% SDS를 보충하여 핵막을 용해합니다. 그 후 재현탁된 샘플에 250단위의 벤조나제 뉴클레아제를 첨가하여 핵산을 소화합니다.

잘 섞은 후 37도에서 2분간 배큐하세요. 최적의 절단 온도의 냉동 샘플을 위해 조직을 에탄올 물과 PBS로 세척한 후 다지고 히스톤 추출을 하세요. 1.5밀리리터 튜브에 담긴 FFPE 샘플에 파라핀 용해제를 1밀리리터 추가하고, 최대 속도로 30초간 소용돌이를 돌려 파라핀이 완전히 녹을 때까지 가열합니다.

샘플을 16,000 G에서 실온에서 3분간 원심분리한 후, 펠릿을 피하는 작은 팁이 달린 피펫으로 상청액을 조심스럽게 버립니다. 이제 펠릿에 95% 에탄올 1밀리리터를 추가하고 최대 속도로 30초간 소용돌이로 보텍스하세요. 샘플을 16,000g 온도에서 실온에서 3분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다.

샘플을 재수화한 후, 펠릿에 추출 버퍼 200마이크로리터를 추가하세요. 3밀리미터 마이크로 팁을 사용해 디지털 기호와 교류하여 추출 버퍼 내 조직을 균질화합니다. 균질화 후 샘플을 열혼합기에서 배양하고 튜브 뚜껑을 잠시 열어 포름알데히드가 증발하도록 합니다.

샘플을 원심분리한 후, 상청액을 새 라벨링된 튜브로 옮기세요. 10킬로달톤에서 18킬로달톤 사이의 핵심 히스톤 단백질 분자량에 해당하는 젤 밴드를 메스로 절단합니다. 젤 밴드를 자른 후에는 같은 메스를 사용해 잘린 젤 조각을 1.5밀리리터 튜브에 옮깁니다.

젤을 염색하기 위해, 아세토니트릴 50% 용액을 이중 증류수에 넣고, 실온에서 분당 1,400회전으로 10분간 열믹서에서 배양합니다. 젤 조각을 100% 아세토니트릴로 탈수하세요. 열믹서를 분당 1,400회전으로 실온에서 10분 동안 섞으세요.

상청액을 버린 후, 젤 조각을 실온에서 진공 원심분리기에서 5분간 건조시킵니다. 다음으로, 각 튜브에 7.7몰 프로포니칸하이드라이드 용액 15마이크로리터와 1몰 중탄산암모늄 26마이크로리터를 추가하여 배양합니다. 그 후 샘플을 1몰 중탄산암모늄 80마이크로리터와 함께 배양합니다.

그 후 젤 조각을 이중 증류수로 세 번 세척한 후 각 배양 후 액체를 버립니다. 다음으로 젤 조각에 50% 아세톤 니트릴을 첨가하고 실온에서 분당 1,400회전으로 15분간 배양합니다. 그 다음 100% 아세토니트릴을 넣어 젤 조각을 완전히 탈수시키세요.

열믹서에서 분당 1,400회전으로 15분간 실온에서 배양하세요. 액체를 버린 후, 젤 조각을 진공 원심분리기에서 실온에서 5분간 건조시킵니다. 젤 조각이 들어있는 각 튜브에 트립신 용액 4마이크로리터와 소화 완충제 20마이크로리터를 추가하세요.

튜브를 얼음 위에 10분간 배양하여 트립신이 젤에 흡수되도록 하세요. 트립신이 완전히 흡수되면, 80마이크로리터의 소화 완충제를 넣어 젤 조각을 완전히 덮고, 튜브를 37도 섭씨에서 열믹서에서 하룻밤 배양합니다. 소화된 펩타이드를 추출하기 위해, 각 튜브에 100마이크로리터의 100% 아세토 니트릴을 첨가하고, 실온에서 분당 1,400회전으로 20분간 열믹서에서 배양합니다.

이제 상정액을 조심스럽게 채취해 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮기세요. 남은 젤과 함께 aceto nitro 추출을 반복한 후, 상청액을 모으세요. 모인 펩타이드를 진공 원심분리기에 농축하여 부피가 1에서 5마이크로리터 사이가 되도록 합니다.

그 다음 1몰 트리에틸암모늄 중탄산염 2마이크로리터와 페닐 이소시안네이트 용액 3마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 분당 350회전으로 37도 섭씨에서 90분간 열믹서에서 배양합니다. 유도체화를 막으려면, 각 튜브마다 1%트리클로로아세트산 8마이크로리터를 첨가하세요.

마지막으로, 각 샘플을 100마이크로리터의 완충제 A를 희석한 후, 희석된 샘플을 C18 단계 팁에 적재하여 용출합니다. 히스톤 추출은 각 조직 유형에 특화된 차등 처리 워크플로우를 통해 신선한 냉동, OCT 냉동 및 FFPE 샘플에서 성공적으로 달성되었습니다. 낮은 농축도와 배경 단백질 존재에도 불구하고, 라인의 FFPE1과 FFPE2 밴드에서 약 1마이크로그램의 H3.1 표준과 일치하는 것으로 나타나 FFPE 샘플에서 히스톤 H3, H2A, H2B, H4가 성공적으로 추출되었습니다.

FFPE 유래 히스톤의 나노 액체 크로마토그래피 및 MS 분석에서는 55분 구배에 걸쳐 히스톤 펩타이드가 성공적으로 분리되었고, 전체 이온 크로마토그램에서 명확한 보존 시간 피크가 나타났습니다. 추출된 이온 크로마토그램은 각 M × Z 값에 대해 별도의 용출 프로파일을 가진 변형되지 않은 메틸화 형태의 H3 K 4의 검출 및 정량을 확인했습니다. 각 변형에 대한 상대적 풍부도 비율을 계산할 수 있게 합니다.

정상 조직과 종양 샘플 간 히스톤 변형 비교 분석에서는 특정 유형에서는 유의미한 증가와 다른 유형에서는 감소하는 것으로 나타났습니다.