Name: LEXY 및 LINuS 광유전학 도구 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 광유전학 도구와 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 생물학 연구에서 수송 메커니즘을 효율적으로 분석하는 새로운 접근법을 제시합니다.

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<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
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주요 세포 경로를 조절하고 세포 항상성을 유지하기 위한 핵세포질 수송(nucleocytoplasmic transport, NCT)의 중요성은 지난 몇 년 동안 잘 연구되어 왔습니다1. 그 결과, NCT의 역학 2,3,4를 연구하기 위한 몇 가지 도구가 생성되었습니다. 이러한 도구 중 2014년과 2016년에 각각 발표된 LINuS5 및 LEXY6 광유전학 프로브는 살아있는 세포에서 NCT를 모니터링할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. 형광 리포터의 유도 가능한 내보내기(LEXY) 또는 가져오기(LINuS)를 따르도록 설계된 이러한 도구는 청색광 노출에 의해 유도되고 가역적입니다.
요컨대,이 두 개의 작은 프로브는 식물 Avena sativa7의 단백질 광 트로핀 -1에서 LOV2 도메인의 특성을 사용합니다. 청색광이 없을 때 LOV2 영역의 Jα 나선은 광경화되어 단백질 코어에 내장됩니다. Jα 나선은 빛 자극에 반응할 수 있기 때문에 청색광에 의한 조명은 구조적 변화를 유도하고 이후 LOV2 영역에서 Jα 나선의 도킹 해제를 유도합니다. LEXY 및 LINuS의 저자는 이 광 감도를 사용하여 LINuS 및 LEXY에 대해 각각 NLS(Nuclear Localization Signal) 또는 NES(Nuclear Export Signal)를 Jα 나선에 융합했습니다(그림 1). 그 결과 생성된 도구는 청색광 조명에서 핵(LINuS) 또는 세포질(LEXY)로 전위되는 프로브입니다.
형광 이미징으로 프로브를 추적하기 위해 mCherry 형광 리포터도 구조물에 추가되었습니다. 마지막으로, 약한 NES(LINuS의 경우) 또는 NLS(LEXY의 경우)를 시스템에 추가하여 프로브가 핵과 세포질 사이의 LEXY 또는 LINuS 전좌를 관찰하지 못하게 하는 청색광 조명 전에 최종 국소화에 있지 않도록 했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
그림 1: LEXY 및 LINuS 프로브의 표현. 두 프로브 모두 빛에 민감한 LOV2 도메인에 융합된 mCherry 단백질로 구성됩니다. 두 툴의 차이점은 Jα-helix에 의해 숨겨진 신호 시퀀스, 즉 LEXY용 NES와 LINuS용 NLS에 있습니다. 또한 두 프로브 모두 초기 국소화를 제어하기 위해 약한 신호 시퀀스를 가지고 있습니다: LEXY의 경우 약한 NLS이고 LINuS의 경우 약한 NES입니다. 따라서 청색광 조명에 의한 시스템 활성화는 LEXY에 대한 수출 또는 LINuS에 대한 수입을 유도하여 사용자가 핵 수출 또는 수입을 모니터링 할 수 있도록합니다. 약어: LEXY = 광 유도성 원자력 수출 시스템; LINuS = 광 유도 핵 국소화 신호; NLS = 핵 국소화 신호; NES = 핵 수출 신호. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
mCherry 형광의 국소화는 핵과 세포질 사이의 LEXY 및 LINuS 프로브의 셔틀을 보고하므로 라이브 셀 이미징에서 추적할 수 있으므로 사용자가 NCT를 모니터링할 수 있습니다. LEXY 및 LINuS는 간단한 프로브로 사용되는 것 외에도 in vitro 5,6,8,9 또는 in vivo10,11의 국소화를 제어하고 관심 단백질을 연구하도록 설계할 수 있습니다.
LEXY 및 LINuS 간행물에서 제안된 정량화 방법은 프로브의 상대적인 핵 강도를 보여줍니다. 제안된 분석은 수동으로 수행되며 핵과 세포질의 관심 영역(ROI) 측정에 의존합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 프로브의 신호를 잘 표현하지만, 특히 실험과 조건이 반복되는 경우 매우 길고 지루합니다. 중요한 것은 이 방법은 설계된 구획의 작은 부분만 표시되기 때문에 정확도가 부족하다는 것입니다.
여기에서는 LEXY 및 LINuS 형광 신호 정량화를 위한 새로운 프로토콜을 제안합니다. 우리는 분석을 용이하게 하고 더 높은 정확도를 제공하는 자동화된 기술을 구현했습니다. 이렇게 하면 이러한 도구의 새 사용자를 위한 프로세스가 쉬워지고 처리량을 늘리는 데 도움이 됩니다. 당사의 정량화 프로토콜은 FIJI의 오픈 소스 TrackMate12 플러그인이라는 하나의 인터페이스만 사용합니다. 특히, 정량화의 신뢰성을 개선하기 위해 실시간 이미징 호환 가능한 원적외선 DNA 마커를 사용하여 TrackMate12를 사용하여 프로브의 형광 신호 추적 및 측정과 결합된 훈련된 컨볼루션 신경망인 StarDist13으로 전체 핵 분할을 수행했습니다.
그런 다음 얻은 데이터를 즉시 사용할 수 있는 제공된 스프레드시트(보충 표 S1)로 쉽게 내보내 식별된 각 핵의 상대적 핵 강도를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 Yoo 및 Mitchison14 에서와 같이 얻은 시간 경과 곡선을 단일 지수 모델에 피팅하여 얻은 값을 그래프에 풀링하는 방법과 테스트된 다양한 조건에 대한 전송 속도를 계산하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜과 분석을 위해 제공된 스프레드시트를 통해 사용자는 제한된 생물정보학 기술로도 살아있는 세포 이미징 데이터를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐</td><td>시그마-알드리치</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>라이카</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>깁코</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>뛰어나다</td><td>마이크로소프트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 소프트웨어</td><td>피지</td><td></td><td>이미지J 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>불소 요리</td><td>두처</td><td>FD3510-100 시리즈</td><td>대안: Attofluor 챔버(Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>그래프패드 프리즘 10.4.1</td><td>그래프패드 소프트웨어, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수입타졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>렙토마이신 B</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>LEXY 플라스미드</td><td>아드진</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>LINuS 플라스미드</td><td>아드진</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>펜실린-스트렙토마이신</td><td>깁코</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 프리 DMEM</td><td>깁코</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>스피로크롬</td><td>SC007 시리즈</td><td>대안: SPY-DNA650(스피로크롬 #SC501)</td></tr><tr><td>Stardist 2D 플러그인</td><td>스타 디스트</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>TrackMate 플러그인</td><td>트랙메이트</td><td></td><td>트랙메이트-7.14.0</td></tr></tbody></table>

lexy 및 linus 광유전학 도구 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화합니다.

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

위에서 언급한 프로토콜은 사용자가 라이브 셀 이미징에서 획득하는 동안 프로브의 위치 파악 및 전좌를 시각화할 수 있도록 해야 합니다. LEXY를 사용한 핵 수출을 시각화하기 위해 획득한 예상 이미지의 예가 그림 4에 나와 있습니다. 핵에서 나오는 신호의 급격한 감소와 세포질의 농축은 청색광 조명을 두 차례 실시한 후에 관찰되어야 합니다. 프로브 신호의 점진적 복구는 조명 주기를 중지한 후에 볼 수 있습니다. 시스템을 제어하기 위해 내보내기 억제제인 Leptomycin B는 청색광 조명에서 LEXY가 내보내지는 것을 방지하기 때문에 분석을 통해 내보내기 변화를 시각화할 수 있음을 증명합니다(그림 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
그림 4: 시간 경과에 따른 LEXY 신호의 시각화. 안정 단계, 조명 및 회복 단계의 대표적인 시점을 라이브 셀 이미징으로 획득하여 캡처합니다. 메탄올 조건은 제어 조건을 나타냅니다. 펄사타일 청색광 조명(빨간색)을 받으면 LEXY의 위치를 알려주는 mCherry 형광 신호가 핵에서 세포질로 전위됩니다. 조명을 멈춘 후 신호는 핵에서 복구됩니다. 수출 억제제인 렙토마이신 B를 1 nM 또는 0.5 nM으로 처리하면 수출이 차단되었을 때 LEXY의 수출이 부재 또는 감소하는 것을 보여줍니다. 스케일 바 = 30μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
분석과 관련하여, 안정 단계 동안 상대 핵 강도 곡선의 값은 약 1이어야 하지만, 청색광 활성화 후에는 조명 단계가 끝날 때 고원에 도달할 때까지 천천히 감소해야 합니다(그림 5A). 감소가 너무 빠르거나 너무 느리면 획득 매개변수를 최적화할 수 있습니다(논의 참조). 충분한 농도의 렙토마이신 B 처리는 또한 분석 및 기술이 핵 수출이 완전히 차단되었음을 보여줄 만큼 충분히 민감하다는 것을 확인할 수 있으며, 전체 실험에 대해 상대 핵 강도 값이 약 1로 안정적임을 확인할 수 있습니다. 그러나 중간 렙토마이신 B 농도는 가벼운 핵 수출을 나타내야 합니다(그림 5A). 이러한 육안 관찰은 수출 속도의 관찰을 통해 정량적으로 확인해야 합니다(그림 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
그림 5: LEXY의 예상되는 상대적 핵 강도 및 수송 속도. (A) 그래프는 시간 경과에 따른 LEXY 형광 신호의 상대적 핵 강도를 나타내며, 안정상의 mCherry 평균 강도로 정규화되었습니다. 메탄올(대조군, 빨간색) 상태의 상대적 핵 강도는 0.5nM(연한 파란색) 또는 1nM(진한 파란색)의 농도에서 수출 억제제 Leptomycin B로 처리된 세포와 대조적으로 조명 후 절반으로 감소합니다. 오차 막대: SEM. (B) 곡선을 단일 지수 모델에 피팅하여 얻은 제어 및 Leptomycin B 조건의 내보내기 속도. 내보내기가 렙토마이신 B에 의해 차단될 때 얻은 값은 제어 조건보다 현저히 낮습니다. N = 메탄올(빨간색)의 경우 18개 세포, 렙토마이신 B 0.5nM(연한 파란색)의 경우 19개 세포, 렙토마이신 B 1nM(진한 파란색)의 경우 15개 세포. P 값은 양측 Welch의 t 검정에 의해 계산되었습니다. : P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 S1: 미리 정의된 계산이 있는 스프레드시트. 이 스프레드시트는 분석을 용이하게 하기 위해 제공됩니다. TrackMate로 얻은 강도 값을 스프레드시트에 직접 복사하여 붙여넣어 정규화된 상대 핵 강도 값을 얻을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 S2: LEXY 분석의 제어 조건에 대한 예상 결과의 예. 스프레드시트는 LEXY의 안정 세포주의 제어 조건에 대해 얻은 값의 예를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

LEXY 및 LINuS 광유전학 도구 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화합니다.

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

우리 연구실은 핵 기공과 염색질 조직 사이의 상호 작용을 연구합니다. 그래서 우리는 핵 기공이 염색질 조직에 어떤 영향을 미치는지 연구할 뿐만 아니라 염색질 조직이 특히 핵세포질 수송에서 핵 기공 기능에 영향을 미치는지 여부도 반대로 연구합니다. 핵세포질 수송은 매우 빠른 과정이므로 한 가지 과제는 살아있는 세포에서 핵세포질 수송 역학의 변화를 감지하는 것입니다.살아있는 세포에서 핵세포질 수송을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 도구는 많지 않습니다. 반자동화되고 개선된 기술을 구현함으로써 이러한 도구의 사용을 용이하게 하기를 희망합니다. 우리의 프로토콜은 딥 러닝을 기반으로 합니다.오류를 제한하고 분석에 필요한 시간을 크게 줄여줍니다. 이전에는 하루가 걸렸던 일이 이제는 한두 시간밖에 걸리지 않습니다. 시작하려면 컴퓨터 시스템에서 FIJI 소프트웨어를 실행하십시오.안정 단계를 이미지 1로, 조명 단계를 이미지 2로, 복구 단계를 이미지 3으로 선택합니다. 세 단계를 나타내는 세 개의 이미지를 연결하여 단일 이미지를 생성합니다. 파일로 이동하여 TIFF로 저장을 선택하여 분할을 위해 얻은 병합된 이미지를 저장합니다.그런 다음 이미지, 색상 및 분할 채널을 선택하여 mCherry 채널을 분할합니다. 그런 다음 파일, 다른 이름으로 저장 및 TIFF로 이동하여 분할 이미지를 저장합니다. 획득 중 표백을 확인하려면 이미지(Image), 스택(Stacks) 및 플롯 Z축 프로파일(Plot Z-axis Profile)을 순차적으로 선택합니다.그런 다음 데이터를 클릭한 다음 첫 번째 데이터 세트 복사를 클릭하고 Z축 프로필 셀 아래에 제공된 스프레드시트에 붙여넣습니다. 이제 분석, 도구를 차례로 클릭하고 ROI 관리자를 클릭하여 핵의 평균 크기를 근사화하는 원형 관심 영역을 그립니다. ROI를 추가하고 더보기로 이동하여 저장을 클릭하여 저장합니다.저장된 ROI를 타임랩스 동안 셀이 없는 영역에 배치합니다. 분석 및 측정 설정에서 평균 회색 값"이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 더보기, 다중 측정을 클릭합니다.Measure all 50 slices"와 One ROI per slice"를 선택하고 OK를 클릭하여 강도를 기록합니다. 측정된 모든 강도 값을 복사하여 ROI 배경 셀 아래에 제공된 스프레드시트에 붙여넣습니다. 그런 다음 mCherry 채널만 있는 이미지를 닫고 병합된 채널로 저장된 이미지를 선택합니다.이제 플러그인, 추적 및 TrackMate를 순차적으로 클릭하여 TrackMate 플러그인을 엽니다. 시점 범위가 0에서 49까지인지 확인하고 다음을 클릭합니다. StarDist 감지기를 선택하고 다음을 클릭합니다.핵 분할을 위해 채널 2, SiR-DNA를 선택하고 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 임계값 창에 기본 매개변수를 그대로 두고 다음을 클릭합니다. 평균 강도, 채널 1을 사용하여 필터를 생성하여 극단적인 신호 값을 가진 핵을 제외합니다.하나의 필터를 만들어 정의된 임계값 이상의 값을 선택하고 다른 필터를 만들어 임계값 미만의 값을 선택합니다. 마찬가지로 두 개의 영역 필터를 추가하여 파편이나 죽어가는 세포를 제거하고 다음을 클릭합니다. Simple LAP 트래커를 선택하고 다음을 클릭합니다.다음으로 추적 매개변수를 조정합니다. 연결 최대 거리"를 30마이크로미터로, 갭 닫힘 최대 거리"를 15마이크로미터로, 갭 닫힘 최대 프레임 간격"을 3으로 설정합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.계산 후 다음을 클릭하여 트랙에 필터를 설정합니다. 전체 시간 코스 동안 추적된 핵만 선택하려면 트랙에서 가장 많은 수의 스폿을 선택하고 다음을 클릭합니다. 그런 다음 스폿 이름 표시"를 선택하여 추가 분석에서 각 핵을 되추적하고 원하는 대로 다른 디스플레이 기능을 사용자 정의합니다.페이지 하단에서 트랙을 클릭하고 CSV로 내보내기"를 선택하여 측정 테이블을 저장합니다. 테이블을 닫고 다음을 클릭하여 계속 진행합니다. 이제 Capture overlay"를 작업으로 클릭한 다음 Execute를 누른 다음 OK를 눌러 추적된 핵이 있는 이미지를 생성합니다.파일을 순차적으로 클릭하고 다른 이름으로 저장을 클릭하고 TIFF를 선택하여 이미지를 저장합니다. TrackMate CSV 파일을 제공된 스프레드시트로 가져오려면 데이터 탭을 클릭합니다. Get Transform Data"그룹에서 From Text/CSV"를 클릭하고 Import를 클릭합니다.Spot IDB, Track IDC, Frame I 및 평균 강도 채널 1M 열을 복사하여 제공된 스프레드시트의 A-D 열에 붙여넣습니다. 먼저 B5 셀의 트랙 ID, 개별 핵을 기준으로 결과를 알파벳순으로 정렬한 다음 C5 셀의 프레임, 시점을 기준으로 정렬합니다. 이제 GraphPad Prism을 열고 새 시트를 만든 다음 스프레드시트에서 시간 열을 복사하여 붙여넣습니다. 그런 다음 상대 핵 강도로 얻은 값을 GraphPad Prism 테이블에 붙여넣습니다.상대 핵 강도 그래프를 생성하려면 그래프 섹션으로 이동하여 그래프 패밀리로 XY를 선택합니다. 그런 다음 그래프 유형으로 오차 막대가 있는 점 및 연결 선"을 선택합니다. 플롯 설정에서 평균 및 오차"와 SEM을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 내보내기 속도를 얻으려면 새 데이터 테이블을 클릭하고 안정 및 조명 단계에 대해서만 소수점 이하로 시간을 입력합니다.이러한 상에 대한 상대 핵 강도로 얻은 값을 표에 붙여넣습니다. 결과 섹션에서 XY 분석을 클릭한 다음 지수를 클릭합니다. 그런 다음 비선형 회귀를 선택하고 확인을 클릭합니다. 매개변수 아래의 모델로 Plateau then then one phase decay"를 선택합니다.그런 다음 2.25와 같은 상수를 X0으로, 1과 같은 상수를 Y0으로, 고원에 대해 0과 같은 상수를 선택합니다. K가 0보다 커야 함을 나타내고 확인을 누릅니다. 새 테이블을 만들고 얻은 K 값을 붙여넣어 전치합니다. 그래프 섹션에서 그래프 패밀리로 열을 선택하고 그래프 유형으로 바이올린 플롯을 선택합니다.플롯으로 모든 점 표시"를 선택하고 확인을 클릭합니다. 광유전학적 프로브 lexy를 사용한 핵 수출은 살아있는 세포 이미징에서 시각화되었습니다. 메탄올 처리 세포를 사용한 대조군 조건에서 핵 mCherry 강도는 청색광 조명 후 급격히 감소한 후 조명 후 단계에서 점진적으로 회복되었습니다. 수출 억제제인 렙토마이신 B를 사용한 치료는 프로브 신호가 모든 시점에 걸쳐 일관되게 핵으로 유지되었기 때문에 핵 수출에 변화를 일으켰습니다.상대 핵 강도에 대한 정량적 분석은 시간이 지남에 따라 조명 단계가 끝날 때 정체기에 도달할 때까지 천천히 감소하는 것으로 나타났습니다. 중간 렙토마이신 B 농도는 가벼운 핵 수출을 나타내야 합니다. 강도 데이터에서 계산된 수출률은 메탄올 처리된 세포에서 상당히 높은 수출률, 0.5나몰 렙토마이신 B의 경우 훨씬 낮은 수출률, 1나노몰 렙토마이신 B에서는 거의 수출이 없음을 확인했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

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일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

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Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

배우세요 광유전학 도구와 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 생물학 연구에서 수송 메커니즘을 효율적으로 분석하는 새로운 접근법을 제시합니다.

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