2025년 7월 22일
이 프로토콜은 광유전학 도구를 통해 핵세포질 수송을 추적하여 얻은 살아있는 세포 이미징 데이터의 자동 분석을 효율적으로 설정하고 수행하는 방법을 설명합니다.
우리 연구실은 핵 기공과 염색질 조직 사이의 상호 작용을 연구합니다. 그래서 우리는 핵 기공이 염색질 조직에 어떤 영향을 미치는지 연구할 뿐만 아니라 염색질 조직이 특히 핵세포질 수송에서 핵 기공 기능에 영향을 미치는지 여부도 반대로 연구합니다. 핵세포질 수송은 매우 빠른 과정이므로 한 가지 과제는 살아있는 세포에서 핵세포질 수송 역학의 변화를 감지하는 것입니다.
살아있는 세포에서 핵세포질 수송을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 도구는 많지 않습니다. 반자동화되고 개선된 기술을 구현함으로써 이러한 도구의 사용을 용이하게 하기를 희망합니다. 우리의 프로토콜은 딥 러닝을 기반으로 합니다.
오류를 제한하고 분석에 필요한 시간을 크게 줄여줍니다. 이전에는 하루가 걸렸던 일이 이제는 한두 시간밖에 걸리지 않습니다. 시작하려면 컴퓨터 시스템에서 FIJI 소프트웨어를 실행하십시오.
안정 단계를 이미지 1로, 조명 단계를 이미지 2로, 복구 단계를 이미지 3으로 선택합니다. 세 단계를 나타내는 세 개의 이미지를 연결하여 단일 이미지를 생성합니다. 파일로 이동하여 TIFF로 저장을 선택하여 분할을 위해 얻은 병합된 이미지를 저장합니다.
그런 다음 이미지, 색상 및 분할 채널을 선택하여 mCherry 채널을 분할합니다. 그런 다음 파일, 다른 이름으로 저장 및 TIFF로 이동하여 분할 이미지를 저장합니다. 획득 중 표백을 확인하려면 이미지(Image), 스택(Stacks) 및 플롯 Z축 프로파일(Plot Z-axis Profile)을 순차적으로 선택합니다.
그런 다음 데이터를 클릭한 다음 첫 번째 데이터 세트 복사를 클릭하고 Z축 프로필 셀 아래에 제공된 스프레드시트에 붙여넣습니다. 이제 분석, 도구를 차례로 클릭하고 ROI 관리자를 클릭하여 핵의 평균 크기를 근사화하는 원형 관심 영역을 그립니다. ROI를 추가하고 더보기로 이동하여 저장을 클릭하여 저장합니다.
저장된 ROI를 타임랩스 동안 셀이 없는 영역에 배치합니다. 분석 및 측정 설정에서 평균 회색 값"이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 더보기, 다중 측정을 클릭합니다.
Measure all 50 slices"와 One ROI per slice"를 선택하고 OK를 클릭하여 강도를 기록합니다. 측정된 모든 강도 값을 복사하여 ROI 배경 셀 아래에 제공된 스프레드시트에 붙여넣습니다. 그런 다음 mCherry 채널만 있는 이미지를 닫고 병합된 채널로 저장된 이미지를 선택합니다.
이제 플러그인, 추적 및 TrackMate를 순차적으로 클릭하여 TrackMate 플러그인을 엽니다. 시점 범위가 0에서 49까지인지 확인하고 다음을 클릭합니다. StarDist 감지기를 선택하고 다음을 클릭합니다.
핵 분할을 위해 채널 2, SiR-DNA를 선택하고 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 임계값 창에 기본 매개변수를 그대로 두고 다음을 클릭합니다. 평균 강도, 채널 1을 사용하여 필터를 생성하여 극단적인 신호 값을 가진 핵을 제외합니다.
하나의 필터를 만들어 정의된 임계값 이상의 값을 선택하고 다른 필터를 만들어 임계값 미만의 값을 선택합니다. 마찬가지로 두 개의 영역 필터를 추가하여 파편이나 죽어가는 세포를 제거하고 다음을 클릭합니다. Simple LAP 트래커를 선택하고 다음을 클릭합니다.
다음으로 추적 매개변수를 조정합니다. 연결 최대 거리"를 30마이크로미터로, 갭 닫힘 최대 거리"를 15마이크로미터로, 갭 닫힘 최대 프레임 간격"을 3으로 설정합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.
계산 후 다음을 클릭하여 트랙에 필터를 설정합니다. 전체 시간 코스 동안 추적된 핵만 선택하려면 트랙에서 가장 많은 수의 스폿을 선택하고 다음을 클릭합니다. 그런 다음 스폿 이름 표시"를 선택하여 추가 분석에서 각 핵을 되추적하고 원하는 대로 다른 디스플레이 기능을 사용자 정의합니다.
페이지 하단에서 트랙을 클릭하고 CSV로 내보내기"를 선택하여 측정 테이블을 저장합니다. 테이블을 닫고 다음을 클릭하여 계속 진행합니다. 이제 Capture overlay"를 작업으로 클릭한 다음 Execute를 누른 다음 OK를 눌러 추적된 핵이 있는 이미지를 생성합니다.
파일을 순차적으로 클릭하고 다른 이름으로 저장을 클릭하고 TIFF를 선택하여 이미지를 저장합니다. TrackMate CSV 파일을 제공된 스프레드시트로 가져오려면 데이터 탭을 클릭합니다. Get Transform Data"그룹에서 From Text/CSV"를 클릭하고 Import를 클릭합니다.
Spot IDB, Track IDC, Frame I 및 평균 강도 채널 1M 열을 복사하여 제공된 스프레드시트의 A-D 열에 붙여넣습니다. 먼저 B5 셀의 트랙 ID, 개별 핵을 기준으로 결과를 알파벳순으로 정렬한 다음 C5 셀의 프레임, 시점을 기준으로 정렬합니다. 이제 GraphPad Prism을 열고 새 시트를 만든 다음 스프레드시트에서 시간 열을 복사하여 붙여넣습니다. 그런 다음 상대 핵 강도로 얻은 값을 GraphPad Prism 테이블에 붙여넣습니다.
상대 핵 강도 그래프를 생성하려면 그래프 섹션으로 이동하여 그래프 패밀리로 XY를 선택합니다. 그런 다음 그래프 유형으로 오차 막대가 있는 점 및 연결 선"을 선택합니다. 플롯 설정에서 평균 및 오차"와 SEM을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 내보내기 속도를 얻으려면 새 데이터 테이블을 클릭하고 안정 및 조명 단계에 대해서만 소수점 이하로 시간을 입력합니다.
이러한 상에 대한 상대 핵 강도로 얻은 값을 표에 붙여넣습니다. 결과 섹션에서 XY 분석을 클릭한 다음 지수를 클릭합니다. 그런 다음 비선형 회귀를 선택하고 확인을 클릭합니다. 매개변수 아래의 모델로 Plateau then then one phase decay"를 선택합니다.
그런 다음 2.25와 같은 상수를 X0으로, 1과 같은 상수를 Y0으로, 고원에 대해 0과 같은 상수를 선택합니다. K가 0보다 커야 함을 나타내고 확인을 누릅니다. 새 테이블을 만들고 얻은 K 값을 붙여넣어 전치합니다. 그래프 섹션에서 그래프 패밀리로 열을 선택하고 그래프 유형으로 바이올린 플롯을 선택합니다.
플롯으로 모든 점 표시"를 선택하고 확인을 클릭합니다. 광유전학적 프로브 lexy를 사용한 핵 수출은 살아있는 세포 이미징에서 시각화되었습니다. 메탄올 처리 세포를 사용한 대조군 조건에서 핵 mCherry 강도는 청색광 조명 후 급격히 감소한 후 조명 후 단계에서 점진적으로 회복되었습니다. 수출 억제제인 렙토마이신 B를 사용한 치료는 프로브 신호가 모든 시점에 걸쳐 일관되게 핵으로 유지되었기 때문에 핵 수출에 변화를 일으켰습니다.
상대 핵 강도에 대한 정량적 분석은 시간이 지남에 따라 조명 단계가 끝날 때 정체기에 도달할 때까지 천천히 감소하는 것으로 나타났습니다. 중간 렙토마이신 B 농도는 가벼운 핵 수출을 나타내야 합니다. 강도 데이터에서 계산된 수출률은 메탄올 처리된 세포에서 상당히 높은 수출률, 0.5나몰 렙토마이신 B의 경우 훨씬 낮은 수출률, 1나노몰 렙토마이신 B에서는 거의 수출이 없음을 확인했습니다.
이 프로토콜은 핵세포질 수송 과정에 초점을 맞춘 생체 세포 이미지 데이터의 자동화된 분석을 위한 효율적인 설정 및 실행을 설명합니다. 이 방법론에서 옵토유전학 도구의 사용은 세포 수송 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
Quantitative analysis of nucleocytoplasmic transport (NCT) dynamics is critical for understanding cellular homeostasis and disease mechanisms relevant to neurodegeneration. The integration of LEXY and LINuS optogenetic probes with automated image analysis enables high-throughput, reproducible measurement of NCT in live cells, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This workflow enhances portfolio decision-making by providing scalable, standardized data on transport mechanisms implicated in disease.
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling high-content, quantitative analysis of nucleocytoplasmic transport in live cells.