확장 현미경: 기존 현미경을 이용한 고해상도 형광 영상
2025년 12월 19일
여기서는 냉동 고정 및 확장 현미경 기법(Cryo-ExM)을 결합한 상세 프로토콜을 제시하여, 다양한 생물학적 샘플에 적응된 구조 보존과 고해상도 영상을 가능하게 합니다. 생물학적 샘플은 냉동되어 팽창성 폴리머에 삽입되고, 변성, 팽창, 면역표지되어 표준 광학 현미경으로 초해상도 영상을 가능하게 합니다.
우리는 미세소관과 그에 따른 다양한 모델 유기체의 역할을 연구하는 세포 생물학자입니다. 우리는 이들이 세포 조직, 형태 발생, 섬모 형성 및 분열에서 하는 역할을 조사하는 것을 목표로 합니다. 지난 5년간 우리는 특히 팽창현미경을 통해 원형 분자 조성에 대한 이해에 기여해 왔습니다.
그리고 이를 통해 우리는 이들의 조립과 기능의 핵심 특징을 드러냅니다. 확장 현미경과 냉동 고정을 결합함으로써, 저희 프로토콜은 초해상도 현미경의 주요 한계를 극복하면서도 세포 요소의 거의 원래 구조를 보존하면서도 고해상도 영상을 가능하게 합니다. 확장 현미경은 저렴하고 구현하기 쉬운 기술로, 모든 실험실에서 초해상도 접근을 가능하게 합니다.
시작하면, 주사기와 바늘을 사용해 각 5밀리리터 튜브에 1밀리터리터의 추가 건조 아세톤을 화학 후드 아래에 채웁니다. 튜브를 금속 선반에 세워 넣고 액체 질소에 넣어 냉동하세요. 30x30cm 두께의 두께 폴리스티렌 상자의 절반을 드라이아이스로 채우고, 증발이 멈출 때까지 Vitrobot 타입 듀어에 액체 질소를 채웁니다.
이제 거미를 플런싱 장치에서 꺼내 금속 플러싱 챔버에 액체 에탄을 채웁니다. 에탄이 평형에 도달할 때까지 10분간 기다립니다. 그 다음 12밀리미터 커버슬립에 얇은 핀셋을 넣어 휴지에 톡톡 두드려 커버슬립에서 남는 미디엄을 흡수하세요.
커버슬립을 반쯤 잡고, 크라이오 플런저와 호환되는 클램핑 링이 장착된 핀셋을 사용하세요. 커버슬립을 고정한 핀셋을 크라이오 플런저 홀더에 넣고, 왓맨 페이퍼로 남은 매체를 닦아내세요. 크라이오 플런저를 작동시켜 커버슬립을 금속 챔버에 담긴 에탄 용액에 잠기세요.
그 다음, 커버슬립을 얼린 아세톤이 든 튜브로 빠르게 옮깁니다. 커버슬립이 담긴 튜브를 약 45도 각도로 드라이아이스에 담가세요. 밀폐된 용기를 50에서 100 RPM으로 설정된 궤도 셰이커에 올려놓고, 4도 섭씨에서 하룻밤 동안 저어 온도가 점차 올라가도록 하세요.
다음으로, 상자에서 드라이아이스 대부분을 꺼내세요. 궤도 셰이커에서 추가로 45분 동안 교란을 이어가며 온도가 영하 80도에서 영하 20도까지 올라가도록 하세요. 각 관을 잠시 열고 닫아 내부 압력을 풀어주세요.
그 후 각 커버슬립을 12웰 플레이트나 미리 냉각된 100% 에탄올 용액으로 채워진 적절한 용기에 옮깁니다. 5분간 부화 후에는 커버슬립을 등급 에탄올 계열에 다시 수분을 공급합니다. 커버슬립을 PBS로 옮긴 후 현미경 아래에 두세요.
가는 핀셋으로 표면을 부드럽게 긁고, 모든 커버슬립이 올바른 면을 위로 향하도록 정렬하세요. 커버슬립을 2% 아크릴아마이드 0.5에서 1밀리리터 양의 PBS에 1.4% 포름알데히드 용액을 채운 4웰 플레이트에 넣습니다. 그 후 이 용액에서 37도 섭씨에서 교반 없이 배양하세요.
다음으로, 10% APS와 젤화 용액을 얼음 위에 10분간 해동한 후 겔레이션을 합니다. 얇은 습지 층과 파라필름을 사용해 습윤 챔버를 준비하세요. 그 후 4도 섭씨에서 보관하세요.
10분 후, 습한 챔버를 콜드 블록 위에 올려 젤화 시 사용하세요. 이제 단백질 고정액에서 커버슬립을 떼어내고, 휴지로 두 번 연속으로 닦아내세요. APS를 겔화 용액에 첨가하여 최종 농도가 0.5%에 도달하고 2초에서 3초간 소용돌이를 사용한다.
그 후 습한 챔버의 파라필름에 35마이크로리터 방울 두 방울을 피펫 위에 피펫 넣고, 각 커버슬립을 젤화 용액 쪽을 향하게 하여 부드럽게 덮습니다. 습한 챔버를 37도 인큐베이터에 30분에서 60분 동안 옮기세요. 변성 검사를 위해서는 직경 0.4센티미터의 생검 펀치 도구를 사용해 젤 조각을 추출한 후, 1밀리리터의 변성 완충제가 채워진 6웰 플레이트에 넣습니다.
플레이트를 10분에서 15분 동안 교반시켜 젤이 커버슬립에서 분리될 때까지 한 후, 분리된 젤 조각을 신선한 변성 완충제가 채워진 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 젤을 95도 섭씨에서 90분간 배양하세요. 배양 후에는 젤을 이중 증류수에 10분간 담가 세척합니다.
밀리미터 용지를 사용해 젤의 직경을 측정하여 젤 팽창 계수를 평가하세요. 약 200마이크로리터의 폴리라이신 용액으로 코팅 슬립을 깨끗이 세척하세요. 커버슬립을 실온에서 1시간 정도 부양한 후, 과도한 폴리리신을 제거하기 위해 이중 증류수로 세 번 세척하세요.
커버슬립이 마른 후에는 4도 섭씨에서 보관하다가 다시 사용할 때까지 보관하세요. 젤을 세포가 위를 향하도록 올바른 방향으로 보풀 없는 종이에 놓고 말려 과도한 수분을 제거하세요. 마지막으로, 말린 젤을 세포가 아래로 향하게 하여 폴리-D-라이신 코팅된 커버슬립 위에 부착합니다.
냉동 고정은 NHS 에스터와 ATP5A 염색에서 확인된 바와 같이 PFA 고정보다 RPE1 세포 내 미토콘드리아 네트워크를 더 효과적으로 보존했으며, PFA 고정에서는 보이지 않는 미토콘드리아 크리스타의 해소를 가능하게 했습니다. 냉동 고정은 PFA 고정에 비해 유사분열 RPE1 세포에서 세포질 및 별상 미세소관을 포함한 동적 미세소관의 보존을 더 잘 이끌어냈다. 트리파노소마 브루세이의 냉동 고정은 PFA 고정에 비해 미토콘드리아의 구조와 전반적인 세포 구조를 더 잘 보존했으며, TDH 및 NHS 에스터 염색으로 시각화되었습니다.
또한, 냉동 고정은 BIP 염색에 기반한 PFA 고정보다 소포체를 더 잘 보존했습니다. 냉동 고정된 RPE1 세포에서 균열이 관찰되었으나, 미토콘드리아나 미세소관 같은 소기관의 초구조를 파괴하지는 못했습니다. 저한 냉동 고정은 기포 같은 구조와 물결 모양의 미세소관, 막성 소기관의 완전성 상실로 나타났다.
팽창 품질은 아크릴레이트 나트륨 용액의 투명도에 따라 달라졌으며, 사용 가능한 용액은 무색이거나 약간 노란색과 반투명을 띠고, 사용할 수 없는 용액은 흐리고 주황색으로 보였습니다.
개요
이 연구는 생물학적 샘플의 고해상도 이미지화를 위해 극저온 고정과 확대 현미경(Cryo-ExM)을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 세포 요소의 거의 원래 구조를 보존하여 표준 광학 현미경으로 초고해상도 이미지화를 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 현미경 기술
- 구조 생물학
배경
- 미세소관은 세포 조직과 기능에서 중요한 역할을 합니다.
- 확대 현미경은 분자 조성을 연구하는 데 사용되었습니다.
- 극저온 고정은 전통적인 방법에 비해 세포 구조의 보존을 향상시킵니다.
- 초고해상도 현미경 기술은 구조 보존에서 제한을 자주 겪습니다.
연구 목적
- 극저온 고정과 확대 현미경을 결합한 프로토콜을 개발합니다.
- 세포 구조의 고해상도 이미지화를 가능하게 합니다.
- 영상 촬영 중 동적 미세소관 및 세포 소기관의 보존을 개선합니다.
사용된 방법
- 극저온 고정을 사용한 생물학적 샘플 준비.
- 확대 현미경을 위한 팽창 가능한 폴리머에 샘플 매립.
- 특정 세포 구성 요소를 시각화하기 위한 면역 라벨링.
- 영상 촬영을 위한 표준 광학 현미경의 사용.
주요 결과
- 극저온 고정은 PFA 고정보다 미토콘드리아 네트워크를 더 효과적으로 보존했습니다.
- 동적 미세소관은 더 잘 보존되어 상세한 영상 촬영이 가능했습니다.
- 미토콘드리아 및 소포체를 포함한 세포 소기관의 구조가 유지되었습니다.
- 극저온 고정된 세포의 일부 균열에도 불구하고 구조적 무결성이 관찰되었습니다.
결론
- Cryo-ExM 프로토콜은 고해상도 이미지화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 전통적인 초고해상도 현미경의 제한을 극복합니다.
- 이 기술은 다양한 연구실에 적용 가능하고 비용 효율적입니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Expansion microscopy with cryo-fixation enables nanoscale imaging of cellular structures using standard fluorescence microscopes, overcoming the resolution and preservation limitations of conventional super-resolution methods. This capability supports early discovery and target validation by providing high-fidelity visualization of organelles and cytoskeletal elements in near-native states. The approach enhances predictive confidence in structural biology workflows and broadens access to advanced imaging for diverse R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of subcellular architecture relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by preserving dynamic structures such as microtubules and organelles.
- Facilitates mechanistic de-risking through artifact-minimized imaging of cellular assemblies.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, high-resolution biological systems for quantitative imaging assays.
- Standardizes sample preservation and expansion for reproducible assay outputs.
- Enables scalable imaging workflows using conventional confocal platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on cellular ultrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular phenotypes in preclinical models.
- Maintains translational continuity by minimizing fixation artifacts across sample types.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-resolution structural data.
- Provides mechanistic insights into organelle and cytoskeletal dynamics relevant to therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling high-resolution imaging without specialized nanoscopy infrastructure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing native cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides measurable expansion factors and structural readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures continuity of structural data from cell lines to whole organisms.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly accessible, cost-effective imaging capability for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-fixation, hydrogel embedding, and fluorescence imaging.
- Needs access to confocal or widefield fluorescence microscopes and basic cryo-infrastructure.
- Demands cross-team standardization of fixation and expansion protocols for reproducibility.
- Adaptable to a range of model systems, from cultured cells to whole organisms.
- Expansion quality depends on reagent clarity and precise handling, as supported by source observations.
