설치류 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 매핑을 위한 초음파 국소화 현미경

우리 연구는 뇌의 미세혈관 구조와 흐름을 특성화하는 동시에 초해상도 초음파 방법을 개선하는 것을 목표로 합니다. 최근 발전으로 마이크로버블 추적이 최적화되고, 가공 파이프라인이 강화되어 ULM을 이용한 초해상도 혈관 매핑을 위한 보다 안정적인 프로토콜이 개발되었습니다. 시작하면, 마취된 마우스를 입체 타격 프레임에 올려놓고, 온열 패드는 섭씨 37도로 설정되어 있습니다.

단단하지만 손상을 주지 않는 압력으로 발가락이나 꼬리를 꼬집어 반사 신경이 없는지 확인하고 적절한 마취 깊이를 확인하세요. 시술 중 눈 궤양과 백내장 형성을 방지하기 위해 양쪽 눈에 연고를 바르세요. 이제 트리머로 쥐 머리를 깎아보세요.

제모 크림을 바르세요. 1분에서 최대 1분 30분 정도 두었다가 따뜻한 물로 꼼꼼히 헹구고, 거즈로 말리세요. 다음으로, 원심분리된 초음파 젤을 머리에 바르어 음향 결합을 보장합니다.

꼬리 정맥 카테터 삽입 시에는 27게이지 반인치 윙드 주입 세트를 18게이지 반인치 바늘과 8인치 튜브에 연결하세요. 가능하면 튜브를 짧게 하여 데드 볼륨을 최소화하세요. 동물의 꼬리를 부드럽게 90도 돌려 옆쪽 꼬리정맥을 드러내세요.

그 후 카테터 삽입 중 안정성을 유지하고 움직임을 방지하기 위해 꼬리를 테이프로 고정하세요. 이제 꼬리 정맥을 확인해 보세요. 정맥 가시성을 높이기 위해 미지근한 물로 꼬리를 데워 혈관 확장을 촉진하세요.

손가락으로 꼬리 밑부분을 부드럽게 누르고, 혈류 방향을 맞춰 주사 부위 쪽으로 밀어 넣으세요. 베벨이 위를 향하게 정맥과 평행하게 바늘을 꽂으세요. 혈류 플래시백이 있는지 관을 관찰해 바늘 위치가 정확한지 확인하세요.

영상 시스템에서 기능 초음파 획득 소프트웨어를 실행하고 새로운 실험 세션을 생성하세요. 초음파 프로브 위치를 조정하세요. 이제 소프트웨어에서 라이브 뷰 획득을 시작하고, 파워 도플러 영상을 사용해 프로브를 실시간으로 조정해 뇌를 화면에 집중시키세요.

명암과 압축 같은 영상 파라미터를 최적화하여 시각화 품질을 향상시킵니다. 그 다음, 획득 소프트웨어에서 Angio 3D 메뉴를 열어보세요. 뇌를 완전히 덮도록 스캔 매개변수를 조정한 후 스캔 획득을 시작하세요.

획득 소프트웨어를 열어두고, Angio 3D가 끝나면 분석과 시각화를 위해 IcoStudio 소프트웨어를 실행하세요. 혈관조영술 3D 스캔을 검토용으로 불러와. 뇌 등록 패널로 이동해 완전 자동 또는 수동 모드로 3D 초음파 스캔을 등록하세요.

완료된 등록을 BPS 파일로 저장하세요. 이제 브레인 내비게이션 메뉴를 열고 아래로 스크롤해 아틀라스 관리자 패널로 가세요. 부모와 자식 트리 내비게이터를 사용해 Allen Mouse 뇌 아틀라스를 탐색하고, 3뷰 패널에서 오버레이할 원하는 해부학적 영역을 선택하세요.

관심 영역과 겹치는 영상 평면을 선택하세요. 코로나 뷰에서는 원하는 영상 단면을 정의하기 위해 두 개의 마커를 수동으로 배치합니다. 그 다음 BPS 위치 설정을 클릭하여 선택한 영상 평면의 모터 좌표를 추출하세요.

혈관조영술 3D 스캔 이미지 미리보기를 검토한 후 BPS 좌표 복사를 클릭하세요. IcoScan 소프트웨어로 전환하고 Move 프로브 패널을 열어보세요. 뉴로내비게이션을 클릭하고 복사한 값을 붙여넣으면, 시스템이 프로브를 선택한 영상 평면과 자동으로 정렬하도록 합니다.

그 후 실시간 영상 촬영을 시작하여 현재 영상 평면이 이전에 선택한 평면과 일치하는지 확인합니다. 멸균 주사기를 사용해 0.9% 염화나트륨 용액 5밀리리터를 초음파 조영제 마이크로버블 바이알에 비중격을 통해 주입합니다. 바이알을 20초간 세게 저어 미세방울을 재현지하고 균일하게 확산되도록 하세요.

초음파 시퀀스, 프레임 속도, 총 녹화 시간 등 녹화 매개변수를 미리 정의하세요. 그 후 주입할 원하는 양의 미세방울을 채취하고 획득을 시작하세요. 획득이 시작되면 적절한 희석액으로 쥐용 100마이크로리터를 주입하세요.

실시간 시각화 패널에서 대비 강화 확인. 즉시 생리적 액체를 카테터에 주입하여 죽은 부피에 남아 있는 미세방울을 세척하세요. 수집이 완료될 때까지 기다렸다가 기록된 데이터를 저장하세요.

Icolab 소프트웨어를 열고 초음파 위치 현미경 탭을 클릭하세요. 그 후 Compute ULM 맵을 클릭하여 처리 워크플로우를 시작하세요. 이전에 획득한 데이터가 포함된 소스 폴더를 선택하세요.

그 후 처리할 특정 스캔 파일을 선택하고 필요에 따라 처리 시간 경계를 조정하세요. 다음 버튼을 클릭하여 보고 단계로 이동하세요. 처리된 파일을 저장할 출력 폴더 경로를 설정하고, 보고서 이미지의 시각화 매개변수를 설정하세요.

이제 실행 버튼을 클릭하여 데이터 처리를 시작하세요. 완료 후에는 국소화된 마이크로버블 좌표와 밀도, 속도, 후방산란 진폭을 나타내는 TIFF 파일을 포함한 TRK 파일이 생성됩니다. TRK 파일을 IcoStudio에 불러와 처리된 데이터를 탐색하기 시작하세요.

그 후 IcoStudio의 오른쪽 패널을 사용해 대비, 압축, 컬러 맵 등 시각화 매개변수를 조정하여 데이터 표현을 강화할 수 있습니다. 통합 시간을 설정하려면 메인 뷰 하단에 있는 더블 슬라이더를 조정하여 분석의 시작과 종료 프레임을 정의합니다. 밀도 탭은 미세방울 발생 분포를 보여줍니다.

절대 밀도와 방향성 밀도 중 하나를 선택하세요. 그 후 Velocity 탭을 클릭하면 절대, 방향, 축, 측면 모드를 사용해 밀리미터 단위의 마이크로버블 속도를 표시합니다. 이미지 선명도를 높이기 위해 대비, 압축, 속도 임계값을 조정하세요.

그 다음 후방산란 진폭 탭을 탐색해 미세방울 반사율을 확인하는데, 이는 대비를 높이고 미세혈관 구조와 평면 밖 운동을 드러냅니다. 이미지를 고해상도 PNG로 내보내거나, 픽셀 크기를 조절할 수 있는 정량적 분석을 위한 TIFF 파일을 생성할 수 있습니다. ULM으로 획득한 관상쥐 뇌 절편의 미세방울 밀도 지도는 큰 혈관과 미세 모세관 구조를 모두 해명하여 분기와 가지기 패턴을 포함한 상세한 혈관 토포학을 드러냈습니다.

같은 뇌 절편의 속도 지도는 명확한 축 방향 흐름을 보여주었으며, 상향 흐름은 정맥 배출을, 하행 흐름은 동맥 관류에 해당하여, 알려진 피질 혈관 구조와 일치하였다. 후방 산란 진폭 맵은 깊이에 따른 대비를 제공하고, 고도 위치에 따라 선박을 강조하여 평면 밖이나 진폭이 낮은 선박을 분할하는 데 유용했습니다. 같은 마우스에서 약한 간격으로 얻은 혈관 밀도 지도는 강한 공간 겹침을 보여주어 뇌 위치 시스템을 이용한 코로나 평면 표적 추적의 재현성을 확인했다.

세션 전반에 걸쳐 좌측 체감각 피질에 대한 정량적 분석은 혈관 반지름, 속도, 유속에서 유사한 분포를 보이며 측정 재현성을 입증했습니다. 왼쪽 시상(시상) 영역에서도 유사한 재현성이 관찰되었으며, 1주차와 2주차 세션 사이에 혈관 반경, 속도, 유량 값이 일관되었습니다. 이 연구는 초음파 위치 현미경이 생체 내 미세혈관 구조와 흐름의 초해상도 지도를 신뢰성 있게 생성할 수 있음을 입증했습니다.

이 프로토콜은 전용 기능성 초음파 시스템을 사용하여 살아있는 설치류에서 견고한 ULM 획득을 가능하게 하는 표준화된 절차의 필요성을 충족시킵니다.