Ex Vivo 및 In Vivo 이미징을 위한 흡수 분자를 사용한 일시적인 광학 투명화

이 연구는 생체 외 조직과 살아있는 동물 모두에서 생체의학 이미징을 향상시키기 위한 비침습적 전략으로 흡수 분자를 사용하여 조직 제거를 평가하고 구현하는 것을 목표로 합니다. 우리는 식용 염료 타르트라진을 사용하여 조직과 살아있는 동물 모두에서 빠르고 가역적인 광학 투명화를 달성하여 이미징 깊이와 선명도를 크게 향상시킬 수 있음을 입증했습니다. 당사의 프로토콜은 분자를 관찰하여 일시적인 광학 클리어링의 재현성에서 중요한 격차를 해결하고 고급 계산 시각화 기술을 통합하여 특징 가시성을 향상시킵니다.

흡수 분자를 사용한 조직 제거를 위한 자세한 프로토콜을 제공함으로써 우리의 연구는 더 넓은 생물학 및 생물 의학 영상 연구 커뮤니티가 이러한 방법을 자체 연구에 적용할 수 있도록 돕습니다. 우리 연구실은 빛과 조직 사이의 물리적 상호 작용을 탐구하고, 사용 가능한 재료의 범위를 확장하고, 최적화된 광학 이미징 플랫폼을 개발함으로써 이 기술을 발전시켜 왔습니다. 시작하려면 필요한 타르트라진 염료 분말 질량을 계산하여 원하는 용액 부피를 준비하십시오.

계산된 양의 염료 분말을 깨끗한 유리 바이알에 옮깁니다. 부피 측정 피펫을 사용하여 정밀도를 유지하기 위해 필요한 양의 탈이온수를 바이알에 추가합니다. 염료가 실온에서 완전히 녹지 않으면 유리 바이알을 섭씨 40도로 예열된 실험실 오븐에 10분 동안 또는 완전히 녹을 때까지 넣으십시오.

그런 다음 염료 용액을 30초에서 1분 동안 소용돌이치게 하여 완전히 용해되도록 합니다. 생체 외 조직의 경우 닭 가슴살 조직을 콜라겐 섬유와 평행한 방향으로 원하는 두께로 자르고 얇게 썬 조직을 물로 부드럽게 세척합니다. 두 개의 깨끗한 현미경 슬라이드 사이에 조직을 놓아 두께를 측정합니다.

슬라이드를 부드럽게 누르고 버니어 구경을 사용하여 조직 중심의 거리를 측정합니다. 다음으로 준비된 염료 용액에 조직을 담그십시오. 그리고 용기를 궤도 셰이커에 놓고 분당 100회전으로 10분 동안 흔듭니다.

깨끗한 집게를 사용하여 염료 용액에서 조직을 제거합니다. 두 개의 투명 유리 슬라이드 사이에 샘플을 놓고 적절한 해상도와 배율로 설정된 디지털 또는 과학 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 외부 빛 간섭을 최소화하기 위해 제어된 조명 환경에서 이미징 프로세스를 수행합니다.

광학 투과율을 측정하려면 준비된 샘플을 UV 가시선 근적외선 분광계에 넣습니다. 측정 일관성을 유지하기 위해 시스템이 적절하게 기준선이 설정되어 있고 염료 용액으로 처리 전후에 광선이 동일한 조직 영역을 통과하는지 확인하십시오. 절차를 위해 마취된 동물을 섭씨 37도에서 단련된 가열 패드 위에 놓습니다.

작은 동물 이발기를 사용하여 원하는 이미징 영역에서 털을 다듬습니다. 다듬은 부위에 제모 크림을 60초 이내에 바르면 잔여 모발을 제거하고 즉시 크림을 제거합니다. 자극을 방지하기 위해 알코올 물티슈를 사용하여 피부를 청소하십시오.

이미징 설정을 준비하려면 저체온증을 방지하기 위해 동물 아래에 섭씨 37도로 설정된 가열 패드를 놓습니다. 광원과 카메라를 정렬하여 고품질 이미지를 캡처합니다. 0.65몰 타르트라진 용액을 0.3%에서 0.4%의 아가로스 겔과 혼합하여 적용합니다.

점적기를 사용하여 준비된 용액을 실험에 따라 배나 머리의 피부에 바릅니다. 흡수를 시작할 때까지 용액을 몇 초 동안 그대로 두십시오. 이제 면봉으로 도포 부위를 부드럽게 문질러 용액을 고르게 분포시키고 피부 흡수를 향상시킵니다.

그런 다음 깨끗한 면봉으로 해당 부위를 부드럽게 마사지하고 필요에 따라 용액을 더 바르십시오. 점차적으로 균일한 색상으로 합쳐지는 주황색 빨간색 점의 모양을 관찰하여 성공적인 염료 침투와 광학 투명화의 시작을 나타냅니다. 피부가 투명해지고 내부 장기가 보일 때까지 해당 부위를 계속 마사지하는데, 일반적으로 작은 부위의 경우 약 3-5분이 소요됩니다.

유리 슬라이드나 커버 슬립을 피부 위에 부드럽게 올려 표면 광택을 줄이고 반사를 최소화합니다. 면봉이나 물에 적신 부드러운 천을 사용하여 피부에서 염료 용액을 부드럽게 닦아냅니다. 광학 클리어 효과가 역전되고 피부가 점차 원래의 불투명한 모습으로 돌아갑니다.

가스 마취를 끈 후 동물이 의식을 되찾도록 하십시오. 동물이 완전히 깨어나 움직이면 집 케이지로 돌려보내십시오. 처리되지 않은 생체 외 닭 가슴살 조직에서는 기본 패턴이 보이지 않았으며 분광계 데이터는 조직 두께가 증가함에 따라 감소하는 낮은 투과값을 보여주었습니다.

0.65몰 타르트라진 용액으로 치료한 후 조직이 눈에 띄게 투명해졌고 밑에 있는 격자와 로고 패턴이 선명하게 나타났습니다. 가시 스펙트럼의 모든 두께에 걸쳐 투과율 값의 상당한 증가도 관찰되었습니다. 살아있는 쥐에서 0.65몰 타르트라진 용액을 적용하면 치료 후 몇 분 이내에 피부를 통해 내부 장기를 시각화할 수 있어 복부 부위의 투명도가 눈에 띄게 증가했습니다.

두피의 광학 청소를 통해 피부를 외과적으로 제거하지 않고도 뇌 혈관을 시각화할 수 있어 뇌 영상에 대한 기술의 효과를 입증했습니다. 클리어 효과는 완전히 되돌릴 수 있었습니다. 조직을 물로 헹구면 몇 시간 내에 불투명도가 회복되고 정상적인 피부 모양이 회복되었으며 며칠에 걸쳐 모발 재성장이 관찰되었습니다.