마우스에서 최적화된 최소 침습 경공막 망막하 주사 기술

망막하 주사는 유전성 망막 질환 치료법의 전임상 조사를 위한 중요한 도구입니다. 이 비디오에서는 마우스에 최적화된 최소 침습 망막하 주사 기술을 소개합니다. 경공막 망막하 주사는 광수용체 및 RPE에 물질을 전달하는 훌륭한 방법입니다.

그러나 이 기술은 기술적으로 까다롭고 재현성과 접근성을 높이기 위해 최적화된 프로토콜을 개발해야 합니다. 우리의 개선 사항에는 마우스 눈꺼풀 검경 개발, 아트로핀의 수술 전 투여, 다이아몬드 나이프를 사용한 정확한 공막 절개술 생성, 바늘 크기 및 주사 접근법의 최적화가 포함됩니다. 우리는 우리 방법의 일관성, 재현성, 우수한 형질도입 범위 및 최소한의 외과적 손상이 과학계에 대한 망막하 주사의 접근성을 향상시킬 수 있기를 바랍니다.

당사의 최적화를 통해 마우스에서 망막하 주사를 더 쉽고 빠르게 수행하고, 실험 변동성을 줄이고, 주사 성공률을 높일 수 있습니다. 이 기술은 향후 전임상 중개 망막 연구를 촉진할 것입니다. 시작하려면 망막하 주사를 수행하기 30분 전에 총 부피 50마이크로리터의 아트로핀 복강내 킬로그램당 1mg을 투여합니다.

원하는 양의 주입액을 유리 마이크로니들에 넣습니다. 바늘을 마이크로 인젝터에 부착하고 보상 압력을 5헥토파스칼로 설정하여 모세관 작용에 대응합니다. 마취된 마우스를 해부 실체 현미경 아래에 놓습니다.

국소 마취를 위해 0.5% 프로파라카인을 눈에 떨어뜨립니다. 0.2% 사이클로펜톨레이트와 1% 페닐에프린을 함유한 혼합물을 눈에 한 방울을 떨어뜨려 망막하 수포의 수술 후 영상화를 위해 동공을 확장하고 수술 중 출혈을 줄입니다. 맞춤형 미니어처 와이어 검경을 사용하여 상원추를 노출시키고 검경을 고정하여 핸즈프리로 위 눈꺼풀을 후퇴시킬 수 있습니다.

각진 Vannas 가위를 사용하여 상결막과 Tenon의 캡슐에서 윤부에서 약 1mm 뒤쪽에 한 쌍의 윤부 절개를 하여 상공막을 노출시킵니다. 주사 부위 위에 남아 있는 Tenon의 캡슐을 조심스럽게 제거합니다. 이제 잠금식 톱니 겸자로 결막 주위 절개술과 건절개술의 앞쪽 가장자리를 잡습니다.

그런 다음 지구를 부드럽게 삽입하여 상공막을 노출시킵니다. 즉시 균형 완충 식염수 한 방울을 눈에 바르면 맨공막에 수분을 공급하고 광학 배율이 더 커집니다. 다이아몬드 칼을 사용하여 윤부에서 약 12시 방향과 1-2mm 떨어진 곳에 정확한 공막 절개술을 합니다.

공막 절개술이 작고 얕은지 확인하기 위해 블레이드를 공막에 접선 방향으로 배치합니다. 수술용 스펀지를 사용하여 눈 표면에서 균형 잡힌 완충 식염수를 모두 부드럽게 제거합니다. 바늘 경사를 공막에 대해 얕은 각도로 잡고 끝을 천천히 공막 절개술에 삽입하여 망막을 관통하지 않고 망막하 공간에 접근하기 위해 0.5-1mm만 전진시킵니다.

바늘을 안정적으로 잡은 상태에서 풋 페달을 사용하여 500헥토파스칼로 주입을 시작하고 15초 동안 지속적인 압력을 유지합니다. 바늘을 제거하고 공막절개 부위를 통해 주입된 용액의 부분적인 역류를 관찰하면 망막하 공간이 주입된 용액의 전체 부피를 수용할 수 없기 때문에 성공적인 전달을 나타냅니다. 추가 역류를 방지하기 위해 지구에 압력을 가하지 않고 잠금 겸자와 눈꺼풀 검경을 조심스럽게 제거하십시오.

주사 직후 망막하 수포 시각화를 돕기 위해 윤활제 눈 연고를 눈에 다량 바르십시오. 경공막 주사 직후 OCT에서 망막하 수포가 명확하게 보였으며 성공적인 분만을 확인했습니다. 망막 색소 상피 또는 RPE를 평가하기 위해 AAV-8 디스트로핀 1-GFP를 표적으로 하는 것을 주입하여 상피층 전체에 광범위한 녹색 형광을 발하여 경공막 접근법을 사용한 효율적이고 광범위한 RPE 형질도입을 나타냅니다.

AAV-8 로돕신 GFP는 간상 광수용체에서 강한 녹색 형광 신호를 유도하여 단면과 안저 모두에서 볼 수 있으며, 이는 광수용체 세포에서 성공적인 표적 지정 및 발현을 나타냅니다. AAV8-CAG-mCherry는 망막층에 걸쳐 광범위한 적색 형광을 생성하여 특정 세포 유형을 넘어 일반화된 이식유전자 발현을 지원하는 이 기술의 능력을 입증했습니다. 망막 용해물의 웨스턴 블로팅은 또한 주사 수포의 중심에 해당하는 최고 수준의 강력한 녹색 형광 단백질 발현을 보여 AAV8 로돕신 GFP를 사용한 광수용체 형질도입을 검증했습니다.

망막 절편의 면역형광 분석을 사용한 AAV 역가 최적화를 통해 표적 세포의 약 90%를 형질도입하는 바이러스 역가를 선택할 수 있습니다. 예를 들어, 이 경우, AAV8 로돕신 GFP 바이러스 스톡의 1 내지 10 희석은 거의 모든 광수용체에서 형질전환 발현을 생성하였다. 대조적으로, 1에서 100으로 희석하면 형질도입 속도가 불충분했습니다.

망막전위도는 경공막 주사가 정상적인 망막 기능을 보존하는 반면 경망막 주사는 A파 및 B파 반응을 현저히 감소시켜 망막 손상을 나타내는 것으로 나타났습니다.