Name: 동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 SLAM 현미경을 이용한 무표지 다중 고조파 영상 기술로 생물학적 샘플의 비선형 광학 특성을 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 세포 및 조직 미세환경을 손상 없이 정밀 분석하여 신경과학과 생물물리학 연구에 활용됩니다.

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비선형 광학 현미경은 강렬한 광학 방사선(3 × 103V/cm보다 큰 전기장을 가진 빛)에 대한 표본의 반응을 활용하여 유도된 편광(따라서 생성된 신호)이 입사 강도 1,2,3에 비선형적으로 의존하는 이미지 대비를 도출합니다. 이러한 다중 대비는 각각 서로 다른 빛-물질 상호 작용에 의해 매개되기 때문에 비선형 현미경은 표본의 형태 및 화학적 환경 모두에 관한 고유한 정보에 동시에 액세스할 수 있습니다 1,2,3. 조명과의 선형 상호 작용을 포함하는 전통적인 현미경 기술도 정량적 이미징을 가능하게 하는 반면, 비선형 현미경은 보다 다중 모드 접근 방식을 허용하여 종종 이미징 깊이와 광학 절편을 개선하는 동시에 샘플에 대한 광손상을 줄입니다4. 조직5,6의 수술 중 조직학과 유사한 평가와 같은 생의학 응용 분야의 맥락에서 이 기술은 천연 생체 분자를 직접 조사할 수 있게 하여 외부 마커나 변형 없이 살아있는 세포의 원활한 조사를 용이하게 합니다. 이 접근법은 태그, 라벨7, 외인성 분자, 유전적으로 발현된 형광 단백질 또는 나노입자의 사용을 피하며, 이는 광범위한 노동이 필요할 뿐만 아니라 표본의 고유 생화학을 방해하고 표적 세포 또는 조직에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 있습니다 8,9,10. 따라서, 비선형 현미경 (nonlinear microscope) 은 표본의 화학적 및 구조적 무결성을 변경하지 않고 미세한 구조의 지속적인 이미징을 제공하는 강력하고 진정한 분석 도구 역할을 합니다. 이 기능은 진단 및 약물 발견에서 세포 신호 전달 및 시스템 생물학에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 열어줍니다.
2광자 자가형광(2PAF), 3광자 자가형광(3PAF), 2차 고조파 생성(SHG) 및 3차 고조파 생성(THG)과 같은 다광자 대비는 각각 샘플 특성화에 분석적 이점을 제공합니다. 2PAF는 내인성 플라빈에 의해 생성되며, 플라빈 아데노신 디뉴클레오티드(FAD)는 생물학적 시스템에서 가장 풍부합니다11. 3PAF는 근적외선 여기를 활용하여 NAD(P)H와 같은 고유 발색단을 시각화하고 UV 관련 광독성 및 감쇠 문제를 우회하면서 대사 이미징을 가능하게 합니다12. SHG는 섬유 콜라겐(유형 I, II 및 III) 및 단백질 배열 13,14,15,16,17과 같은 비중심대칭 분자 구조를 구체적으로 밝혀 구조적 통찰력을 제공합니다 1. 마지막으로, 인터페이스와 작은 구조적 특징에 민감한 THG는 지질 분포 및 세포외 소포를 이미징하는 데 탁월합니다 18,19,20,21,22.
이러한 각 조영 신호는 연구 그룹에 의해 독립적으로 탐구되어 생물학적 응용을 위한 신뢰할 수 있고 다재다능한 도구로서 다광자 비선형 현미경의 틈새 시장을 확립했습니다 23,24,25,26. 이러한 노력은 혁신적인 기술을 활용하여 조직 형태, 세포 대사, 심지어 알츠하이머병 및 암과 같은 병리의 형태 기능적 특징에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위해 혁신적인 기술을 활용한 2PAF 현미경 발명가에 의해 주도되었습니다23. 이들의 연구는 궁극적으로 신경과학 분야의 획기적인 응용을 주도했습니다27,28. 그 후 몇 년 동안 여러 연구자들은 세포에 구조적 지지를 제공하고 암 발병 과정에서 상당한 변화를 겪는 스캐폴드인 세포외 기질의 변화에 대한 SHG의 민감도를 강조했습니다29. 특히, Campagnola et al.14,24,30,31은 SHG 현미경을 통해 고분자 및 초분자 집합체의 시각화를 가능하게 하여 기존의 형광 기반 기술로는 검출할 수 없는 콜라겐의 배열, 농도 및 유형과 같은 세부 사항을 밝힐 수 있음을 입증했습니다. 이러한 결과는 임상 환경에서 실행 가능한 진단 도구로서 SHG 현미경의 잠재력을 강조했습니다. 마지막으로, THG 현미경을 성공적으로 적용하여 설치류의 망막층을 세포내 해상도25에서 시각화하고, 뇌 구조를 매핑하고(32) 흑색종 세포 침범의 다중 계면 지형을 캡처했습니다(33).
비선형 현미경의 이러한 역사적 구현은 일반적으로 비선형 신호를 생성 및 수집하기 위해 높은 개구수(NA) 대물렌즈에 결합된 모드 고정 펨토초(fs) 레이저를 포함했으며, 이는 이색성 거울로 대역 통과 필터로 향하고 광전자 증배관(PMT)34로 수집되었습니다. 유사한 구현에도 불구하고 대부분의 응용 프로그램은 하나 또는 기껏해야 두 개의 대비만 획득하고 나머지는 간과하는 데 중점을 두었습니다. 다광자 현미경의 잠재력을 완전히 실현하기 위해 Boppart et al. 먼저 다중 비선형 대비 21,35,36,37의 순차적 획득을 구현한 다음 동시 검출 4,22,38,39,40,41을 구현했습니다. SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경으로 알려진 결과 기술은 단일 샷 여기 및 다중 검출을 통해 비선형 2PAF, 3PAF, SHG 및 THG 신호를 공간적, 시간적으로 공동 등록하여 우수한 분석 성능을 달성합니다. 이 4개 채널의 시공간적 공동 국소화는 높은 순위의 기능이 풍부한 데이터42를 제공하여 모션 아티팩트를 제거하고 향상된 이미지 등록을 보장함으로써 순차적으로 획득된 데이터에 비해 이점을 제공합니다. 결과적으로, SLAM은 대사 특성을 효과적으로 특성화하는 광학 환원-산화 비율과 같은 복합 특징의 생성을 가능하게 합니다 43,44,45. 또한 양식 전반에 걸친 신호의 결합 분석은 채널의 상관 관계 및 공동 국소화를 기반으로 추가 기능의 엔지니어링을 용이하게 합니다. 예를 들어, Shiet al. 의약품 생산에 사용되는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 정확하게 분류하는 데 있어 SLAM 현미경의 공국소화 특징의 중요성을 입증했습니다42. 이러한 방식으로 SLAM은 현재 다광자 현미경 분야의 최첨단으로 간주되는 것의 토대를 마련하여 해당 분야의 미래 발전을 위한 길을 열어줍니다46.
이 프로토콜에서는 SLAM 현미경의 주요 구성 요소(그림 1)를 간략하게 설명하고 구현을 위한 단계별 방법론을 설명합니다. 여기에는 여기 펄스의 생성 및 형성, 대표적인 조직 표본 준비, 이미징 절차, 처리, 결과 데이터의 표시가 포함됩니다. 기성 기술과 확립된 기술을 활용하여 이 프로토콜은 보편적이고 전송 가능하며 여러 실험실에서 유사한 광학 시스템을 사용하여 쉽게 재현할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
그림 1: 동시 무표지 자가형광 다중고조파(SLAM) 현미경의 광학 설계. 펨토초 레이저는 10MHz의 반복 속도로 370fs 펄스로 1040nm 빛을 출력합니다. 레이저의 강도와 편광은 광자 결정을 펌핑하여 초연속체를 생성하기 전에 신중하게 제어됩니다. 그런 다음 펄스는 펄스 셰이퍼에 의해 압축되어 맞춤형 레이저 스캐닝 현미경(점선 상자)으로 전달됩니다. 이색성 미러 및 대역 통과 필터는 광전자 증배관(PMT) 또는 하이브리드 광검출기(HPD)와 같은 고감도 광자 검출기로 감지되기 전에 샘플에서 생성된 비선형 신호를 분리합니다. 광학 설계는 앞서 설명한 시스템(41)에 기초한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>3축 스테이지</td><td>토르랩스</td><td>MAX316</td><td>중단.</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 이미징 접시</td><td>매텍</td><td>P35G-0-14-C</td><td>코팅되지 않은 #0 커버 유리.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>깁코</td><td>21063029</td><td>고포도당, HEPES, 페놀 레드 없음.</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 배지 보충제</td><td>프로모셀</td><td>C-39210</td><td>송아지 태아 정청을 생략합니다.</td></tr><tr><td>FemtoTrain 펨토초 레이저</td><td>스펙트럼 물리학</td><td>1040-5</td><td>평균 전력: >5.0W, 펄스 에너지: >500nJ, 파장: 1040nm &plusmn; 8 nm, 반복 속도: 10 MHz, 펄스 폭(FWHM): < 220 fs.</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>사이티바</td><td>SH30071.03</td><td>HyClone 특성화.</td></tr><tr><td>섬유 스트리퍼</td><td>토르랩스</td><td>T10S13 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 이나트륨 염 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>F6625</td><td></td></tr><tr><td>검류계 거울</td><td>케임브리지 기술</td><td>6215H</td><td>중단.</td></tr><tr><td>유리 가공 워크스테이션</td><td>비트란</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>이미지J</td><td>위스콘신 대학교 매디슨의 Eliceiri 연구실</td><td>버전 2.16.0</td><td>피지 배포.</td></tr><tr><td>킴와이프 티슈 페이퍼</td><td>킴벌리-클라크 프로페셔널</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>사이티바</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>현미경 스테이지</td><td>응용 과학 기기</td><td>FTP-2050</td><td></td></tr><tr><td>현미경 스테이지 컨트롤러</td><td>응용 과학 기기</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>현미경 자가상관기</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>카르페</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>올림푸스</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>침수, 25X 배율, 1.05 NA.</td></tr><tr><td>광 파워 미터</td><td>뉴포트</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm.</td></tr><tr><td>광학 스펙트럼 분석기</td><td>토르랩스</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>광자 결정 섬유</td><td>NKT 포토닉스</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>큰 모드 영역, 편광 유지. 코어 직경: 15 & micro;m.</td></tr><tr><td>정밀 광섬유 식칼</td><td>후지쿠라</td><td>CT-101 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>펄스 셰이퍼</td><td>바이오포토닉스 솔루션 Inc.</td><td>펨토조크-D</td><td>중단.</td></tr><tr><td>& 베타 ; - 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴 클레오티드, 환원 된 이나트륨 염 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

SLAM 현미경의 복잡한 다중 채널, 다중 모드 접근 방식(그림 1)은 새로운 사용자가 문제를 해결하고 결과를 이해하기 어렵게 만들 수 있습니다. 첫째, 잘 절단된 PCF는 PCF의 길이에 수직인 평평한 표면이 있는 깨끗한 면(그림 2C)을 특징으로 합니다(그림 2A). 각지고 부서진 절단면(그림 2B)과 긁힌 자국(그림 2E)은 절단이 불량함을 나타냅니다. 그림 2D 에 표시된 PCF 표면의 먼지 또는 파편은 절단 후 PCF의 절단 불량 또는 부적절한 취급을 나타냅니다. 가장 중요한 것은 공기 구멍의 벌집 패턴으로 둘러싸인 작은 중앙 영역인 PCF의 코어에 성공적인 절단 시 파편이나 긁힘이 없어야 한다는 것입니...

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

simultaneous-label-free-autofluorescence-multi-harmonic-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

낮은-강도 펄스 초음파 자극 (LIPUS)은 높은 공간 및 시간적 해상도 생 또는 조작 셀의 비-침략 적 기계적 자극에 대 한 양식 적임 이다. 이 문서는 피 형광 현미경 LIPUS를 구현 하는 방법 및 원치 않는 기계적 유물을 방지 하기 위해 초음파 경로 따라 음향 임피던스 불일치를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.

형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱

스펙트럼 이미징은 단일 샘플에서 여러 형광 신호를 식별하고 분리하는 신뢰할 수 있는 솔루션이 되었으며 관심 있는 신호를 배경 또는 자동 형광과 쉽게 구분할 수 있습니다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 필요한 이미지 수집 시간을 줄이면서 동시에 신호 대 잡음 비를 증가시킴으로써 이 기술을 향상시킵니다.

형광 신호를 효율적으로 구별하기 위한 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 현미경 검사법

이 프로토콜은 내인성 대사 조효소, 환원된 니코틴아미드 아데닌(인산염) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)의 형광 이미징 및 분석을 기술한다. NAD(P)H 및 FAD의 자가형광 이미징은 세포 대사를 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴적인 방법을 제공한다.

세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

라만 분광법은 비 접촉에 적합한 기술, 살아있는 세포, 조직 - 엔지니어링 구조와 기본 조직의 라벨이없는 분석입니다. 소스 고유의 스펙트럼 지문가 생성 및 복수 변수 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

배우세요 SLAM 현미경을 이용한 무표지 다중 고조파 영상 기술로 생물학적 샘플의 비선형 광학 특성을 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 세포 및 조직 미세환경을 손상 없이 정밀 분석하여 신경과학과 생물물리학 연구에 활용됩니다.

동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경

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