동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경
August 29th, 2025
이 프로토콜은 레이저 광원 생성, 조직 샘플 준비, 이미징 수행 및 데이터 분석에 대한 세부 정보를 포함하여 SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경 기술에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. SLAM은 조직 미세 환경을 조사하기 위해 4개의 상보적인 무표지 대비를 측정하여 비선형 현미경을 발전시킵니다.
동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경 또는 SLAM 현미경은 빛과의 비선형 상호 작용을 측정하여 생물학적 샘플의 고유한 정보를 캡처합니다. 우리 연구실에서는 이 기술을 사용하여 미세한 규모로 생명과 질병을 연구합니다. 우리는 라벨이 없는 다중 모드 이미징으로의 전환을 관찰하여 세포 및 조직 구조와 역학에 대한 보다 풍부한 통찰력을 제공하는 동시에 독성을 피하고 양식 전반에 걸쳐 보완적인 대비와 상관 관계를 가능하게 합니다.
최첨단 무표지 비선형 현미경은 한 번에 하나의 신호를 획득하여 정렬 불량, 사진 손상 및 많은 동시 프로세스의 위험이 있습니다. SLAM은 엄격하게 공동 등록된 다중 모드 대비를 활성화하여 신뢰할 수 있는 공간 및 시간 데이터를 보장함으로써 이러한 문제를 극복합니다. 이 기술을 사용하면 다광자 현미경에서 4 개의 채널을 동시에 여기 및 감지 할 수 있습니다.
광자 결정 섬유를 사용하여 SHG, THG 및 2광자 및 3광자 형광에 대한 펄스를 넓힙니다. SLAM은 정렬 아티팩트나 외인성 라벨 없이 다중화된 대사 구조 및 동적 세포 신호 전달 정보를 캡처하여 표준화된 정량적 조직 분석을 가능하게 합니다. 그 응용 분야는 기초 생물학, 중개 연구 및 종양학, 신경변성 및 조직 재생의 바이오마커 발견에 걸쳐 있습니다.
시작하려면 분광계 또는 광학 스펙트럼 분석기를 사용하여 포물선 거울 뒤의 레이저를 측정하고 광자 결정 섬유의 초연속체 생성을 확인합니다. 편광 빔 스플리터 뒤의 중간 플레이트를 회전하여 초연속체의 너비를 최적화합니다. 현미경 자가상관기를 켭니다.
소프트웨어에서 검출기를 내부 검출기로 설정하고 스캔 범위를 5피코초로 조정하여 펄스 자기상관의 전체 너비를 캡처합니다. 레이저의 차단을 해제하고 신호가 나타날 때까지 펄스 셰이퍼를 빠져나가는 빔에 자가상관기를 정렬합니다. 셔터 2가 닫혀 있는지 확인합니다.
그런 다음 물이나 기름과 같은 적절한 침지 매체를 대물 렌즈에 도포합니다. 자가상관기 외부 검출기를 현미경 스테이지에 놓고 대물렌즈 바로 위에 배치합니다. 이제 스캐닝 검류계 거울을 켜서 전압을 0으로 설정합니다.
셔터를 열고 형광 타겟을 사용하여 빔이 외부 검출기에 도달하는지 확인합니다. 자가상관 검출기를 외부 검출기로 설정합니다. 그런 다음 신호가 나타날 때까지 s를 조정합니다.
펄스 셰이퍼의 다항식 계수를 조정하여 자기 상관기에 의해 측정된 펄스 폭을 반복적으로 최소화합니다. 펄스 폭이 감소함에 따라 그에 따라 스캔 범위를 줄여 자기 상관 함수의 정확도와 시각화를 향상시킵니다. 광자 결정 광섬유에 대한 레이저 입력이 차단되었는지 확인하고 레이저를 켭니다.
레이저를 30분 동안 예열합니다. 빔 경로에 장애물이 없는지 확인한 다음 광 결정 광섬유 바로 앞의 빔 경로에 광 파워 미터를 배치합니다. 제어 버튼을 눌러 셔터 1을 열고 입력 전력을 측정합니다.
셔터 1을 다시 닫습니다. 포물선 거울 뒤의 광자 결정 섬유의 출력으로 파워 미터를 이동합니다. 셔터 1을 열고 입력 3축 스테이지를 사용하여 출력 전력을 최대화합니다.
광자 결정 섬유를 10분 동안 예열한 다음 3축 스테이지를 사용하여 출력 전력을 다시 최대화하고 PCF의 전송을 기록합니다. 중성 밀도 필터 다음에 파워 미터를 이동하고 필터를 돌려 샘플에 도달하는 레이저 출력을 조정합니다. 측정된 전력에 나머지 광학 장치의 투과율을 곱하여 샘플 전력을 결정합니다.
이제 검류계와 스테이지를 켭니다. 획득 소프트웨어를 실행하고 원하는 이미징 매개변수를 입력합니다. 대물 렌즈에 이전에 적용한 것과 동일한 침지 매체를 사용하여 샘플을 스테이지에 놓습니다.
그런 다음 실내 조명을 끄고 커튼을 닫아 주변 조명이 들어오지 않도록 합니다. 다음으로 검출기 전원 공급 장치와 증폭기를 켭니다. 현미경 스테이지를 둘러싼 라이트 박스를 닫습니다.
전자 제어 스위치를 사용하여 감지기 셔터 3-6을 수동으로 엽니다. 획득 소프트웨어에서 Click to Start Acquisition 옵션을 눌러 SLAM 이미징을 시작합니다. s를 사용하여 현미경 초점을 조정합니다.tage s가 명확하게 보일 때까지 컨트롤러 노브.
현미경 스테이지 컨트롤러의 조이스틱을 사용하여 원하는 시야를 찾습니다. 위치가 지정되면 중지 및 재설정을 클릭합니다. 저장 탭에서 데이터 저장을 예로 전환합니다.
그런 다음 클릭하여 획득 시작 옵션을 누르고 이미징이 완료될 때까지 기다립니다. 이미징 중에 샘플을 조작하려면 검출기 셔터를 닫고 손전등이나 헤드램프를 사용하여 조명을 사용하십시오. 조정 후 이미징 설정으로 돌아갑니다.
이미지 획득을 종료하려면 감지기 셔터를 닫고 감지기를 끈 다음 실내 조명을 켜십시오. 셔터 1을 사용하여 레이저를 차단한 다음 레이저를 끕니다. 검류계와 스테이지를 끄고 수집 소프트웨어를 닫습니다.
조직 샘플을 적절하게 폐기하고 워크스테이션을 청소하십시오. 적절하게 절단된 광자 결정 섬유는 축에 수직인 평평한 단면과 깨끗한 면을 보여주었습니다. 제대로 절단되지 않은 광자 결정 섬유는 각진 절단, 부서진 면, 표면에 뚜렷한 긁힘이나 파편이 나타났습니다.
부적절한 취급이나 오염으로 인해 섬유 표면 주위에 눈에 보이는 먼지와 미립자가 축적되어 공기 구멍 패턴이 가려졌습니다. 어두운 영역이 있는 탄 코어는 수명이 다한 손상된 광자 결정 섬유를 나타냅니다. 초연속체 스펙트럼은 약 975-1, 175나노미터에 걸쳐 평평한 상단과 뚜렷한 스펙트럼 변조를 가지고 있었습니다.
압축 후 맥박 자기상관은 좁은 전폭 절반 최대값을 가진 대칭 프로파일을 보여 양호한 맥박 형성을 나타냅니다. 제대로 작동하는 초연속체 소스는 강력한 2차 및 3차 고조파 신호를 생성했습니다. 좁아진 초연속체는 2차 고조파 신호를 유지하면서 3차 고조파 신호 강도의 손실을 초래했습니다.
펄스 형성이 없으면 모든 비선형 신호가 크게 감소하여 희미하고 대비가 낮은 이미지가 생성되었습니다. 생체 외 신장 조직의 성공적인 SLAM 이미징은 3차 고조파 생성 및 NADPH 형광을 포함하여 여러 개의 강력한 광학 신호를 가진 뚜렷한 네프론 구조를 보여주었습니다. 신장 간질 콜라겐 섬유는 강한 2차 고조파 생성 신호를 통해 식별할 수 있었습니다.
산화환원 비율 이미지는 수질에 비해 신장 피질의 근위 세뇨관에서 호기성 미토콘드리아 대사가 증가한 것으로 나타났습니다. 두 번째 산화환원 비율 맵은 산화 및 해당작용 대사의 공간적 변화를 확인하여 조직 내 차등 에너지 사용을 강화했습니다.
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개요
이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 고유한 정보를 캡처하는 동시 무표지 자가형광 다중 고조파(SLAM) 현미경 기법에 대한 상세한 가이드를 제시합니다. SLAM은 조직 미세환경을 조사하기 위해 네 가지 보완적인 무표지 대조를 측정하여 비선형 현미경을 발전시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물물리학
- 현미경 기법
배경
- SLAM 현미경은 빛과의 비선형 상호작용을 측정합니다.
- 이 기법은 네 개의 채널을 동시에 자극하고 감지할 수 있습니다.
- 세포 및 조직 구조에 대한 더 풍부한 통찰력을 제공합니다.
- SLAM은 독성을 피하고 모달리티 전반에서 보완적인 대조를 가능하게 합니다.
연구 목적
- 현미경 규모에서 생명과 질병을 연구합니다.
- 전통적 이미징의 정렬 불량 및 사진 손상 문제를 극복합니다.
- 신뢰할 수 있는 공간 및 시간 데이터 수집을 가능하게 합니다.
사용된 방법
- 이미징을 위한 조직 샘플 준비.
- SLAM 현미경을 사용한 이미징 수행.
- 이미징 과정에서 얻은 데이터 분석.
- 현미경용 레이저 광원 생성.
주요 결과
- SLAM은 등록된 다중 모달리티 대조를 제공합니다.
- 조직 미세환경에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 수집된 데이터는 신뢰할 수 있고 포괄적입니다.
- SLAM 현미경은 고급 생물학 연구를 촉진합니다.
결론
- SLAM 현미경은 이미징 기법의 중요한 발전입니다.
- 무표지 생물학적 샘플의 상세한 분석을 가능하게 합니다.
- 이 기법은 다양한 생물학 분야의 연구를 향상시킬 준비가 되어 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM) microscopy enables multiplexed, quantitative imaging of tissue structure, metabolism, and cellular dynamics without exogenous labels. This capability addresses the need for standardized, artifact-free, and reproducible data in early discovery and translational research. SLAM's coregistered multimodal outputs support predictive confidence and mechanistic de-risking at critical pipeline inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of metabolic and structural features in native tissue environments.
- Supports functional target validation by correlating morphological and metabolic states.
- Reduces biological ambiguity by providing simultaneous, artifact-free multimodal readouts.
- Facilitates portfolio triage through robust, label-free phenotypic characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, standardized outputs across multiple optical channels.
- Enables high-content, label-free assay development for multiplexed screening platforms.
- Improves screening reliability by eliminating alignment artifacts and photo-damage risks.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant metabolic and structural biomarkers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling non-destructive tissue analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in oncology, neurodegeneration, and tissue regeneration research.
- Enhances predictive de-risking by integrating functional and morphological data in situ.
Pipeline & Workflow Integration
SLAM microscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative imaging for hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multiplexed, label-free imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-content screening workflows.
- Analytics: Provides coregistered measurements of metabolic, structural, and functional tissue features.
- Translational Research: Enables non-destructive, disease-relevant biomarker analysis in human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging platform for cross-program R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optics and advanced microscopy instrumentation.
- Demands access to ultrafast laser sources, photonic crystal fibers, and sensitive detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data processing pipelines.
- Adaptation across tissue types and disease models may require protocol optimization.
- Instrument maintenance and photonic crystal fiber handling are critical for consistent performance.
