Name: zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 zpc:cas9 knock-in 제브라피시를 이용한 모계 돌연변이 생성 방법입니다. Tol2 매개 sgRNA 전달로 난모세포 특이적 조건부 녹아웃을 효율적으로 수행하여 치명적 또는 불임을 유발하는 수정자 돌연변이 연구에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li>Fuentes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+coordinate+system%3A+Molecular-genetics+of+embryonic+axis+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish.</a> Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Huluwa+dictates+the+embryonic+body+axis+through+%CE%B2-catenin+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.</a> Science. 362 (6417), eaat1045(2018).</li>
<li>Abrams, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+maternally-controlled+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions.</a> PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24+controls+poly%28A%29+tail+length+and+translation+efficiency+of+crystallin+mRNAs+in+the+lens+via+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).</li>
<li>Weidinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Xing, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+dishevelled+genes+in+zebrafish+reveals+distinct+functions+in+embryonic+patterning+and+gastrulation+cell+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.</a> PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).</li>
<li>Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+program+of+oocytes+can+be+modified+in+vivo+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.</a> J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+maternal+mutants+via+oocyte-specific+knockout+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system.</a> Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maternal+mutants+via+oocyte+transgenic+expression+of+CRISPR-Cas9+and+sgRNAs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish.</a> Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+targeting-mediated+and+endogenous+gene+integrity-maintaining+knockin+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24a+dictates+mRNA+recruitment+for+germ+granule+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish.</a> EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T5+exonuclease-dependent+assembly+offers+a+low-cost+method+for+efficient+cloning+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+conditional+mutagenesis+using+transgenic+expression+of+Cas9+and+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li>
<li>Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+cells+by+conventional+pneumatic+microinjector%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector.</a> Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+early+embryonic+primordial+germ+cells+promotes+zebrafish+female+differentiation+as+revealed+by+lifetime+labeling+of+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline.</a> Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+formation+of+primordial+germ+cells+from+zebrafish+blastomeres+by+germplasm+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors.</a> Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Bertho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dazl+regulates+cystogenesis+and+germline+stem+cell+specification+during+the+primordial+germ+cell+to+germline+stem+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition.</a> Development. 148 (7), dev.187773(2021).</li>
<li>Houwing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piwi+and+piRNAs+in+germ+cell+maintenance+and+transposon+silencing+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish.</a> Cell. 129 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetally+localised+Vrtn+functions+as+a+novel+repressor+to+modulate+bmp2b+transcription+during+dorsoventral+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish.</a> Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x M5 HiPer Taq PCR 믹스</td><td>메이5바이오</td><td>고양이 #MF001-BD-100</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>MD바이오</td><td>고양이#A006L</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep 플라스미드 미니프렙 키트</td><td>액시젠</td><td>고양이#AP-MN-P-4</td><td></td></tr><tr><td>모세관 전기영동 기기(Qsep400)</td><td>바이옵틱</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>DIG 라벨링 믹스</td><td>로슈</td><td>고양이#11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>로슈</td><td>고양이#4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>고양이#R0861</td><td></td></tr><tr><td>첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트</td><td>트랜스젠 바이오텍</td><td>고양이#AT301</td><td></td></tr><tr><td>GenCrispr NLS-Cas9-NLS 뉴클레아제</td><td>젠스크립트</td><td>고양이#Z03389</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관(1.0 x 100mm)</td><td>란타이 교육 장비 공장</td><td>고양이#OS-2B</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>BBI 생명과학</td><td>고양이#28985</td><td></td></tr><tr><td>그래프패드 프리즘 9</td><td>그래프패드</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>이미지J</td><td>오픈 소스</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>생명 공학</td><td>고양이 #CA1351</td><td></td></tr><tr><td>마이크로포지(MF2)</td><td>나리시게</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 분광 광도계(Nano-300)</td><td>올셩</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>올리비아</td><td>올림푸스</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>깁코</td><td>고양이#15140122</td><td></td></tr><tr><td>피코리터 인젝터(PLI-100A)&nbsp;</td><td>하버드 장치</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>뾰족한 핀셋</td><td>WPI</td><td>고양이#500341</td><td></td></tr><tr><td>뾰족한 핀셋</td><td>&nbsp; WPI&nbsp;</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>풀러(PC-100)</td><td>나리시게</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase 억제제</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>고양이 #EO0381</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>고양이#R0481</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 하이드록실 마그네틱 비드</td><td>상곤바이오텍</td><td>고양이 #B518720-0001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>고양이#M0251L</td><td></td></tr><tr><td>졸드</td><td>WPI</td><td>Cat# Z-금형</td><td></td></tr></tbody></table>

zpc:cas9 knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

Generation of Maternal Mutants Using zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

rbm24a 모계 돌연변이의 빠른 생성 우리는 모계 BFP 마커와 rbm24a 코딩 염기서열을 표적으로 하는 4개의 고효율 sgRNA의 발현을 가능하게 하는 형질전환 벡터를 구축했습니다. Tol2 전위를 통해 이 벡터를 동형접합 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 배아에 도입한 후, Rbm24a-RFP 단백질이 없기 때문에 BFP 양성 F1 배아에서 Mrbm24a를 쉽고 빠르게 식별했습니다(그림e 11A-D). BFP 양성 배아의 약 30%-70%는 RFP 신호가 부족했습니다. 이러한 Mrbm24a 배아는 nanos3 프로브를 사용한 in situ...

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

Oogenesis and early embryonic development are critically dependent on maternally derived mRNAs and proteins. Eliminating these maternal factors ...

generation-of-maternal-mutants-using-zpccas9-knock-in-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

이 비디오는 제브라피시 난황낭에 화합물을 전달하는 배아 미세주입 기술에 대해 설명합니다.

배아 미세주입: 제브라피시 노른자에 화합물을 전달하는 기술

제브라피쉬는 고등 척추동물과의 유전적 유사성으로 인해 발생 생물학 및 인간 질병 연구를 위한 강력한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 초기 배발생에 필수적인 유전자의 열성 돌연변이를 식별하기 위한 전방 스크리닝 전략에 활용할 수 있는 반수체 제브라피시 배아를 만드는 방법론을 설명합니다.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

모체 유전자 산물의 조작에 사용 제브라 난자의 체외 성숙에 최적화 프로토콜은 여기에 제시된다.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

배우세요 zpc:cas9 knock-in 제브라피시를 이용한 모계 돌연변이 생성 방법입니다. Tol2 매개 sgRNA 전달로 난모세포 특이적 조건부 녹아웃을 효율적으로 수행하여 치명적 또는 불임을 유발하는 수정자 돌연변이 연구에 활용할 수 있습니다.

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

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