Name: 단백질-글리칸 상호작용 탐구: 핵 자기 공명의 발전 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 단백질-글리칸 상호작용의 구조 역학과 표면 힘의 역할을 NMR 기술로 연구하는 방법을. 이 연구는 약한 상호작용의 생물학적 기능 이해와 당단백질 진단에 활용됩니다.

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<table><tbody><tr><td>13C 포도당</td><td>Cambrige 동위원소 연구소.</td><td>CLM-481</td><td></td></tr><tr><td>15N 염화암모늄</td><td>Cambrige 동위원소 연구소.</td><td>NLM-467 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>코케텔은 프로테아제를 억제합니다.</td><td>시그마-알드리치</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Cambrige 동위원소 연구소.</td><td>DLM-4</td><td></td></tr><tr><td>D-만노스</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2069-5G</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NMR파이</td><td></td><td></td><td>소프트웨어 자습서 링크: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html</td></tr><tr><td>염화칼륨(K2HPO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>시게미 튜브</td><td>브루커</td><td>Z1Z10684A</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>에스9625</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨(Na2HPO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨(NaH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S97263</td><td></td></tr><tr><td>분광계 Bruker 600MHz</td><td>브루커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광계 Bruker 800 MHz</td><td>브루커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>티아민</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>삼중 공진 TXI 프로브</td><td>브루커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>시그마-알드리치</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질-글리칸 상호작용 탐구: 핵 자기 공명의 발전

Exploring Protein-Glycan Interactions: Advances in Nuclear Magnetic Resonance

본 연구에서는 단백질-글리칸 상호작용을 조사하기 위한 NMR 실험을 제시했습니다. 단백질-글리칸 분자 인식은 세포 접착, 이동, 증식 및 기타 다양한 형태의 세포 통신의 조절을 포함하여 세포외 기질(ECM)과 관련된 수많은 생물학적 과정의 기초가 됩니다.
여기에서 우리는 약한 결합제로 설명되는 단당류 D-만노스로 작업하기로 결정했습니다. 목표는 일시적인 상호 작용을 측정하는 방법을 설명하고 결합 메커니즘을 밝히는 데 있어 그 중요성을 강조하는 것이었습니다. 리간드의 상호 작용 부위를 특성화하기 위해 세 가지 다른 리간드 기반 NMR 접근법이 사용되었습니다.
첫 번째 방법은 CVN이 있는 상태에서 D-만노스의 화학적 이동 섭동(CSP)을 평가하는 것이었습니다. 이를 위해 CVN에 비해 50배 초과된 D-만노스(그림 1A)와 동일한 완충 조건(...

Protein-glycan interactions are central to many biological processes and are increasingly recognized as promising targets for diagnostic strategies in ...

우리는 인테그린-디스인테그린 복합체에 초점을 맞춰 단백질-단백질 및 단백질-글리칸 상호작용을 연구합니다. 우리 모델은 구조 역학을 탐구하고 복잡한 형성 및 상호 작용 안정성을 매개하는 표면력의 역할을 강조합니다. 우리 그룹은 단백질에 존재하는 표면 소수성 클러스터를 연구하여 결합 부위의 분자 인식 및 진화에서 표면력의 역할을 연구하는 데 전념하고 있습니다.NMR 솔루션을 사용하면 단백질 상호 작용을 감지할 수 있습니다. 약한 상호 작용은 생명체에 필수적이지만, 많은 중요한 생물학적 기능에 존재함에도 불구하고 고친화성 복합체에 대한 편향이 있습니다. 우리 그룹은 큰 단백질 복합체를 연구하기 위해 통합 구조 생물학 접근 방식을 사용하는 데 중점을 두고 있습니다.우리는 NMR을 역학 및 기능적 측면을 연구하는 주요 도구로 사용하고 있습니다. 시작하려면 50밀리몰 염화나트륨과 5% 산화중수소가 포함된 pH 7.4의 인산나트륨 완충액에 D-만노스의 4밀리몰 용액을 준비합니다. 용액을 두 개의 샘플로 나누는데, 하나는 80마이크로몰 CVN을 포함하고 두 번째는 포함하지 않습니다.NMR 분광기에서 화학적 이동 섭동을 통해 리간드 결합을 매핑하려면 H1C13 HSQC 획득을 위한 HSQCTOPSI 펄스 시퀀스를 설정합니다. 시간 도메인, 스펙트럼 폭, 반송파 주파수 및 스캔 수를 구성합니다. 제공된 방정식을 사용하여 화학적 이동 섭동을 계산합니다.포화 전달 차이를 통해 리간드 결합을 매핑하려면 먼저 새 데이터 세트를 만듭니다. 다양한 포화 주파수를 스크리닝하거나 포화 시간을 변경하면서 주파수를 고정하여 STD NMR 실험을 위한 매개변수를 구성하여 축적을 평가합니다. ZGPR 펄스 시퀀스를 사용하여 1D H1 NMR 실험을 설정합니다.분광계를 H1에 맞게 조정하고, 시밍을 수행하고, 단단한 90도 펄스를 측정합니다. 반송파 주파수를 물 신호에 해당하는 약 4.7ppm의 중심에 놓은 다음 STDDIFFESGP를 선택합니다. 3 펄스 시퀀스를 선택하고 획득 매개변수를 설정합니다.필요에 따라 스펙트럼 폭을 설정하고, 인터스캔 D1을 4초로 지연하고, 실험 목표에 따라 포화 시간 D20을 정의합니다. FQ2 목록을 마이너스 40ppm의 오프 공명 주파수와 단백질만 포화시키는 공명 주파수로 로드합니다. 마이너스 0.59, 0.73 및 8.1ppm의 공진 주파수를 테스트하여 최적의 조건을 결정합니다.최적의 주파수를 사용하여 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 및 4초의 포화 시간에서 STD 스펙트럼을 획득합니다. 해당 ASTD 값을 포화 시간의 함수로 플로팅합니다. 이제 스캔 수를 64로 설정하고 실험 루프를 4번 평균화합니다.그런 다음 총 스캔 수를 계산합니다. 인터스캔 지연을 4초로 설정하고 획득 시간을 2.7262976초로 설정합니다. 지속 시간을 50밀리초로 설정하고 모양 프로그램 9SP9를 통해 가우스 모양을 제어하여 포화 펄스를 구성합니다.STD NMR 변형에 T1 행 필터를 적용한 다음 단백질 크기에 따라 스핀 잠금 시간 D29를 설정합니다. 리간드 결합 H1 R2를 매핑하려면 먼저 Bruker 표준 라이브러리에서 CPMG_ESGP2D 펄스 프로그램을 선택합니다. 실험을 2D 획득으로 설정합니다.그림과 같이 획득 매개변수를 구성합니다. 그런 다음 각각 8개의 스캔으로 구성된 200주기 동안 실험을 실행합니다. CPMG 주기의 원하는 총 시간에 따라 변수 카운터 목록을 조정합니다.단백질이 포함된 샘플과 리간드 전용 샘플에 대한 두 가지 실험을 실행합니다. EFP 또는 사인 M 명령에 이어 FP를 사용하여 각 TCPMG에 대한 H1 스펙트럼을 플로팅한 다음 최상의 처리 전략에 따라 창 함수를 조정합니다. 방정식을 사용하여 CPMG 몫 Q를 계산합니다.298켈빈에서 N15 표지 CVN의 H1N15HSQC 스펙트럼을 획득합니다. D-만노스로 적정하여 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 및 60밀리몰의 최종 농도에 도달합니다. Bruker 표준 라이브러리의 위상 민감FHSQCF3GPPH 빠른 HSQC 펄스 시퀀스를 사용합니다.그런 다음 공식을 사용하여 화학 이동 섭동을 계산합니다. 방정식 5를 사용하여 해리 상수 KD를 결정하기 위해 D-만노스 농도의 함수로 각 잔기에 대한 CSP 값을 플로팅합니다. 그런 다음 수식을 사용하여 결과 데이터를 단일 결합 등온선에 맞추십시오.위상 민감성 HSQCT2ETF3GPSI3D 펄스 시퀀스를 사용하고 그림과 같이 매개변수를 구성하여 298켈빈에서 60밀리몰 D-만노스가 없거나 존재할 때 CVN 잔기의 개별 잔기의 N15 R2 값을 측정합니다. NMRPipe를 사용하여 의사 3차원 스펙트럼을 처리하여 각 완화 지연에 대해 HSQC와 유사한 스펙트럼을 생성합니다. 처리된 스펙트럼을 분석 플랫폼으로 가져옵니다.그런 다음 모든 스펙트럼을 선택하고 강도 변경 추종 도구를 적용합니다. 각 교차 피크의 강도를 T 이완의 함수로 플로팅하고 붕괴를 단일 지수 함수에 맞춰 각 잔기에 대한 N15 R2 값을 추출합니다. 67.84밀리초에서 HSQC 유사 스펙트럼의 신호 대 잡음비에서 실험 오류를 계산합니다.노이즈만 포함된 스펙트럼 영역을 처리하고 주어진 명령을 사용하여 텍스트 파일로 변환합니다. 그런 다음 통계 소프트웨어를 사용하여 노이즈 영역 또는 노이즈 강도의 표준 편차를 결정합니다. 주어진 방정식을 사용하여 실험 오차를 계산합니다.CVN의 존재 하에서 D-만노스의 두 아노머 형태에 대해 화학적 이동 섭동이 관찰되었으며, 베타-D-만노스에서 더 큰 이동이 관찰되어 우선적 결합을 나타냅니다. CVN의 존재 하에서 대부분의 D-만노스 수소에 대해 자유 및 결합 상태에 해당하는 두 개의 뚜렷한 피크가 관찰되었습니다. 가장 높은 ASTD 값을 나타내는 수소 핵은 CVN과의 강한 양극성 상호 작용과 일치하는 베타-D-만노스와 연관되었습니다.가로 이완율 분석에서 H 베타 4는 CVN에 결합할 때 이완의 현저한 증가를 나타낸 유일한 양성자였습니다. 리간드의 첨가에 의해 유도된 H1 및 N15 화학적 이동 섭동은 최대 10밀리몰의 농도에서 가장 높았습니다. 베타 가닥 내의 잔기 I40, E41, N42, V43, D44 및 G45는 상당한 화학적 이동 교란을 보여 D-만노스에 대한 고친화성 결합 부위로 식별되었습니다.결합 등온선은 잔기 D44가 베타 가닥 잔기 중에서 가장 높은 친화력을 가지며 해리 상수는 약 1밀리몰임을 보여주었습니다. N15 R2 이완률의 측정은 D-만노스 결합 시 델타 R2 값의 증가 및 감소를 모두 보여주었으며, 이는 구조 안정화 및 교환 과정의 혼합을 시사합니다. 잔기 C58, R59, K74 및 R76은 증가된 델타 R2 값을 보여 고친화성 결합 부위에 대한 관여를 확인한 반면, 잔기 F4, C8, R24 및 G27은 저친화성 영역을 나타냈습니다.

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Biochemistry

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이 비디오는 15개의 N-표지된 야생형 및 돌연변이 엔보플라킨 단백질과 표지되지 않은 비멘틴 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명 분광법 기술에 대해 설명합니다. 야생형 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 성공적인 상호 작용은 NMR 스펙트럼에서 광범위한 라인 확장과 피크 소멸로 이어지는 반면, 돌연변이된 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 상호 작용이 없으면 NMR 스펙트럼에서 잘 분리된 피크를 초래합니다.

원자 수준의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

여기, 안정 동위 원소와 핵 자기 공명 (NMR) 분광학 및 눈금을 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용의 후속 묘사는 생산 및 분류는 단백질의 정화에 대 한 프로토콜 선물이 Thermophoresis (MST) 실험입니다.

핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

이 프로토콜은 온라인 리소스로 인간 단백질 글리오를 탐색, 비교 및 해석하는 방법을 보여줍니다.

글리칸 매개 단백질 상호작용 연구를 위한 생물정보학 자료

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

RNA 중합효소와의 전사 인자 (TFs)의 상호 작용은 일반적으로 풀다운 검정을 사용하여 연구됩니다. 우리는 클라미다이얼 RNA 폴리머라제와 GrgA의 상호 작용을 특성화하기 위해 생체층 간섭측정기(BLI) 기술을 적용합니다. 풀다운 분석과 비교하여 BLI는 실시간 연결 및 해리를 감지하고 더 높은 감도를 제공하며 정량적입니다.

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

여기에 제공된 것은 다른 조직과 뇌의 다양한 영역에서 분리된 미토콘드리아를 가진 다른 펩티드 및 단백질의 네이티브 형태, 프리피릴라 및 성숙한 아밀로이드 섬유사이의 상호작용을 조사하기 위한 프로토콜이다.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

학습하세요 단백질-글리칸 상호작용의 구조 역학과 표면 힘의 역할을 NMR 기술로 연구하는 방법을. 이 연구는 약한 상호작용의 생물학적 기능 이해와 당단백질 진단에 활용됩니다.

단백질-글리칸 상호작용 탐구: 핵 자기 공명의 발전

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