녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

우리의 연구 범위는 임신한 여성의 난관에 직접 유전체 편집 성분을 전달하는 자궁 내 전기천공을 사용하여 녹아웃 마우스 생성을 단순화하는 것입니다. 접합자에 미세 주입을 하려면 기증자와 수혜자 암컷, 정관절제된 수컷을 포함한 많은 동물을 유지해야 합니다. 따라서 동물 사용을 최소화하는 프로토콜이 바람직합니다.

접합자 전기천공에 Nepa21 시스템을 사용하는 것은 표준 핵주입 기반 기법과 비슷한 효율로 단일 단계에서 표적 유전자 노크아웃 마우스를 생성할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 우선, 계산 분석 도구를 사용해 관심 유전자를 표적으로 하는 잠재적 단일 가이드 RNA 서열을 식별하는 것입니다. 원하는 돌연변이 부위에 최대한 가까운 엑손에 위치한 서열을 선택하세요. 게놈 브라우저를 사용해 엑솜 구조를 교차 참조하고 대부분의 스플라이스 아이소폼에 포함된 서열을 우선순위로 지정하세요.

도구의 통합 점수 시스템을 사용하여 각 가이드 서열의 예측된 비표적 활동을 분석합니다. 비표적 결합 가능성이 가장 낮은 서열을 선택하세요. 선형 이중 가닥 DNA 템플릿을 생성하려면 주어진 표에 명시된 성분을 사용하여 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.

중합효소는 마지막으로 넣고, 마스터 믹스는 효소 안정성을 유지하기 위해 얼음에 보관하세요. 그 다음 다음 열순환 조건으로 PCR을 실행합니다. 다음, 주어진 성분을 사용해 시험관 내 전사 마스터 믹스를 준비하고, 온도를 일정하게 조절하기 위해 열사이클러를 사용해 37도 환경에서 1.5시간 동안 배양합니다.

그 다음 반응에 2마이크로리터의 DNase I를 추가합니다. DNA 주형을 소화하기 위해 섭씨 37도에서 추가로 30분간 배양한 후, 효소를 75도에서 5분간 비활성화합니다. TRIzol로 RNA를 정제한 후, 분광광도계를 사용해 RNA 농도를 측정하고 A260과 A260과 A230의 비율을 확인합니다.

리보핵단백질 복합체를 형질전환을 위해 뉴클레아제가 없는 물을 사용해 1몰 Tris-HCl 완충제를 100밀리몰라로 희석합니다. 0.022마이크로미터 크기의 주사기 필터를 사용해 용액을 걸러냅니다. 10마이크로리터 단위로 분할하여 4도 섭씨에서 보관하다가 사용하세요.

다음으로, spCas9 뉴클레아제, 단일 가이드 RNA, 그리고 뉴클레아제 없는 튜브에서 DEPC 물로 희석한 Tris-HCl을 사용해 트랜스펙션 믹스를 준비합니다. 트랜스펙션 믹스를 37도 섭씨에서 10분간 배양하여 리보핵단백질 복합체가 형성되도록 합니다. 그 후 트랜스펙션 혼합물을 단일 I-GONAD 세션에 적합한 소량으로 분리하여 시약 활성을 유지하기 위해 4도 섭씨로 유지합니다.

CD1 암컷 마우스와 단일 집 CD1 수컷 마우스를 하룻밤 교미한 후, 각 암컷에게 교미 플러그가 있는지 확인하세요. 플러그가 보이는 암컷만 새로운 우리로 옮겨 추가 실험 절차를 진행하세요. 모든 스테인리스 스틸 수술 기구는 사용 전에 멸균을 위해 오토클레이브하세요.

그 후 전자 저울로 선택한 플러그=양성 암컷 쥐를 마취하기 전에 무게를 재세요. 마취된 쥐의 발가락 꼬집기 반사가 사라졌는지 모니터링하여 적절한 마취를 확인하세요. 시술 중에는 체온을 유지하기 위해 온찜질 패드 위에 마우스를 올려놓으세요.

그 후 수의학 연고를 눈 건조를 예방하세요. 가위를 사용해 허리 아래 피부에 0.7센티미터 세로 절개를 내세요. 그 다음, 가위 끝을 약간 벌려 피부 절개 부위를 약 1.3센티미터까지 부드럽게 확장합니다.

그 후 복막에 0.7센티미터 절개를 하여 복강을 노출시킵니다. 복막 절개를 1.1센티미터까지 확장하고, 약간 열린 가위 끝으로 양쪽으로 밀어냅니다. 난소에 연결된 지방 패드를 찾아 겸자를 이용해 부드럽게 바깥쪽으로 당겨 난소, 난관, 자궁이 드러날 때까지 하세요.

혈관 클램프를 사용해 지방 패드를 고정하여 생식 구조를 안정시키세요. 다음으로, 스트리퍼 피페터를 이용해 일회용 플라스틱 모세관에 리보핵단백질 주입 혼합물 2마이크로리터를 주입합니다. 마이크로 가위를 사용해 난관 벽에 5밀리미터 위쪽 상류에 0.2센티미터 절개를 합니다.

스트리퍼 피페터에 부착된 플라스틱 모세관을 난관 절개에 삽입하고, 공기를 넣지 않고 주입 혼합물을 조심스럽게 배출하세요. 주사를 완성하기 위해 난관에서 플라스틱 모세혈관을 부드럽게 빼내세요. 전면 패널의 전원 스위치를 눌러 전기포공기를 켭니다.

화면에 표시된 대로 장치의 전기천공 파라미터를 설정하세요. 핀셋 전극을 사용해 난관을 부드럽게 잡고 킬로옴 버튼을 눌러 저항을 측정하세요. 저항 측정 직후 시작 버튼을 눌러 전기천공을 시작하고, 옴 버튼에서 종료 신호가 나타날 때까지 기다립니다.

첫 번째 난관을 전기천공한 후, 생식기를 부드럽게 복강으로 되돌려 넣습니다. 절개 부위를 4-0 폴리글리콜산 수술용 봉합사로 봉합하세요. 유전형 분석을 위해서는 18에서 21 뉴클레오타이드 길이의 프라이머를 설계하고, 녹는점 약 60도 Celsius를 사용하여 300에서 600 염기쌍 PCR 산물을 생성합니다.

각 프라이머의 특이성을 확인하기 위해 쥐 게놈 데이터베이스에 대해 BLAST 검색을 수행하여 비특이적 증폭 위험을 제거하세요. 다음으로, 귀 펀치를 사용해 DNA 추출을 위해 쥐의 귀에서 약 2밀리미터 크기의 작은 조직 샘플을 채취합니다. 용해 버퍼 100마이크로리터를 추가하세요.

샘플을 95도 섭씨에서 60분간 배양하고, 효율적인 용해를 위해 20분마다 소용돌이를 일으킵니다. Sanger 시퀀싱을 수행한 후, 결과를 분석하여 유전체 편집 결과를 평가합니다. ICE 분석을 사용하려면 Sanger 시퀀싱 파일을 모두 업로드하고, 가이드 RNA 서열을 입력한 후 CRISPR 실험에 사용된 적절한 뉴클레아제를 선택하세요.

다음으로 TIDE를 사용하려면 대조군과 실험 시퀀싱 파일을 AB1 형식으로 업로드하고 가이드 RNA 서열을 입력하세요. ICE 분석 결과, Cas9 절단 부위에서 세 가지 뚜렷한 인델 변이가 검출되었는데, 42%의 서열에서 1염기쌍 결실, 25%의 염기쌍 결실, 27%의 서열에서 23염기쌍 결실이 발견되었습니다. 모델 적합도는 0.94였고 녹아웃 점수는 69로, 강한 예측 상관관계와 유전자 결출 가능성을 나타냈다.

시퀀스 크로마토그램은 편집된 샘플의 Cas9 절단 부위에서 교란이 확인되었으나, 대조 크로마토그램에서는 같은 부위에 온전한 서열이 보였습니다. 전기공화된 6마리 중 돌연변이가 있는 새끼는 4마리뿐이었으며, 전체 편집 효율은 60%에 달했습니다. 전기로 구멍을 낸 6마리 쥐의 모든 새끼 새끼 수는 감소하여 쥐당 새끼가 3마리에서 4마리에 불과했습니다.