Name: 키메라 항원 수용체-세포외 소포(CAR-EV) 기술 강화: 암 치료의 미래 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 학습하세요 CAR-EV 기술을 활용한 암 치료법으로, 이온 교환 크로마토그래피로 고순도 CAR-EV를 분리하고 나노입자 추적 분석으로 특성을 분석합니다. 이 방법은 고형 종양 및 염증성 질환에 대한 RNA 치료제 전달을 위한 세포 없는 표적 치료 전략을 제공합니다.

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<ol><li>Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+CAR+T-cell+therapeutics+for+hematologic+malignancies%3A+Interpreting+clinical+outcomes+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date.</a> Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).</li>
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<li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis-an+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView%5BTitle%5D)+AND+%22JEV%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis-an accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> JEV. 8 (1), 1596016(2019).</li>
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<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+assessment+of+therapeutic+cargo+in+engineered+exosomes%3Aa+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review.</a> J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).</li>
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<li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).</li>
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<li>Fernandes, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+isolation+of+extracellular+vesicles+from+cell+culture+supernatant+using+immuno-affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Sep+Purif+Technol%22%5BJournal%5D)">Targeted isolation of extracellular vesicles from cell culture supernatant using immuno-affinity chromatography.</a> Sep Purif Technol. 358 (Part A), 130312-130312 (2024).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-EGFR+ScFv+functionalized+exosomes+delivering+LPCAT1+specific+siRNAs+for+inhibition+of+lung+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22JNB%22%5BJournal%5D)">Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases.</a> JNB. 22 (1), 159(2024).</li>
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<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+CAR+T+cell+therapy+targeting+BCMA+and+CD19+in+relapsed%2Frefractory+multiple+myeloma%3Aa+phase+I%2FII+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial.</a> Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).</li>
<li>Roddie, G., Amrolia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+CAR-T+cells+for+B-cell+acute+lymphoblastic+leukaemia+and+B-cell+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma.</a> Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><강함>재료</강함></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td><td>깁코</td><td>10010049</td><td>EV 강화</td></tr><tr><td>1% 도데실 황산나트륨(SDS)</td><td>시그마</td><td>L3771-100G</td><td>SDS 분말 1g을 초순수 10mL에 녹입니다.</td></tr><tr><td>Tween-20이 포함된 트리스 완충 식염수 1개(TBST)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J77500입니다. 케이2</td><td>초순수로 희석하여 1x 용액을 만듭니다(또는 1x 트리스 완충 식염수에 0.1% 폴리소르베이트-20/트윈-20 용액을 준비합니다).</td></tr><tr><td>96웰 투명 평바닥 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트, 멸균</td><td>코 닝</td><td>3595</td><td>시험관 내 기능 분석</td></tr><tr><td>Bolt Bis-Tris Plus 미니 단백질 젤, 4-12%, 1.0 mm, WedgeWell 형식</td><td>인비트로젠</td><td></td><td>셀/EV 특성화</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9647-100G</td><td>셀/EV 특성화</td></tr><tr><td>칼넥신 항체</td><td>세포 신호 전달</td><td>2433초</td><td>셀/EV 특성화</td></tr><tr><td>CAR-NK/T 세포</td><td>프로마브 바이오테크놀로지</td><td>다릅니다</td><td>CAR 세포외 리간드 결합 도메인은 수용자 세포의 선호하는 표적에 따라 달라집니다.</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution 세포 증식 분석(MTS)</td><td>프로메가</td><td>지3580</td><td>시험관 내 기능 분석</td></tr><tr><td>cOmplete, 미니, EDTA가 없는 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>로슈</td><td>11836170001</td><td>세포 용해</td></tr><tr><td>ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약</td><td>아머샴</td><td>RPN2232</td><td>셀/EV 특성화</td></tr><tr><td>용출 완충액</td><td>이노빅</td><td></td><td>EV 강화/격리</td></tr><tr><td>평형 버퍼</td><td>이노빅</td><td></td><td>EV 강화/격리</td></tr><tr><td>EXO-ACE IEX 컬럼</td><td>이노빅</td><td></td><td>다운스트림 기능 분석을 위한 EV 농축/분리 특허 ID AU2024901931</td></tr><tr><td>EXO-NET 판 엑소좀 캡처 비드</td><td>이노빅</td><td></td><td>다운스트림 특성화를 위한 EV 절연 특허 ID WO/2014/011673</td></tr><tr><td>그랜자임 B 항체</td><td>세포 신호 전달</td><td>4275</td><td>셀/EV 특성화</td></tr><tr><td>인간 IL-2 IS, 프리미엄급</td><td>밀테니 바이오텍</td><td>130-097-744</td><td>T/NK 세포의 이종 없는 배양</td></tr><tr><td>iBlot 2 전사 스택, PVDF</td><td>인비트로젠</td><td></td><td>셀/EV 특성화</td></tr><tr><td>면역컬트-XF(cGMP)</td><td>줄기세포 기술</td><td>100-0956</td><td>T/NK 세포의 이종 없는 배양</td></tr><tr><td>K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>시험관 내 기능 분석</td></tr><tr><td>MCF-7 시리즈</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>시험관 내 기능 분석</td></tr><tr><td>Millex-GP 주사기 필터 장치, 0.22 및 마이크로; m</td><td>머크 밀리포어</td><td>SLGPR33RS</td><td>터미널 여과</td></tr><tr><td>재생 버퍼</td><td>이노빅</td><td></td><td>EV 강화/격리</td></tr><tr><td>RIPA 버퍼(10X)</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>9806</td><td>세포 용해</td></tr><tr><td>트리판 블루 용액, 0.4%</td><td>깁코</td><td>15250061</td><td>세포 생존력 및 밀도 평가</td></tr><tr><td>세척 완충액</td><td>이노빅</td><td></td><td>EV 강화/격리</td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 셀 카운터</td><td>인비트로젠</td><td>백작부인 2세 플로리다</td><td>세포 생존력 및 밀도 평가</td></tr><tr><td>벤치탑 자동 추출 기기</td><td>인비트로젠</td><td>KingFisher Apex 시스템</td><td>고처리량 자동 정제 시스템 프로토콜 세부 정보는 링크 참조: https://www.inoviq.com/site/technology/resources</td></tr><tr><td>형광현미경</td><td>자이스</td><td>액시오 옵저버 7</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>나노입자 추적 분석(NTA)</td><td>입자 Metrix GmbH</td><td>제타뷰 PMX-130</td><td>입자 분석</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>BMG 랩텍</td><td>스펙트로스타 나노</td><td>시험관 내 기능 분석</td></tr><tr><td>냉장 탁상용 원심분리기</td><td>베크만 쿨터</td><td>아반티 J-15R</td><td>세포 배양 & EV 농축 처리</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 미니 젤 탱크</td><td>인비트로젠</td><td>A25977</td><td>셀/EV 특성화</td></tr><tr><td>웨스턴 블롯 전사 시스템</td><td>인비트로젠</td><td>아이블롯 2</td><td>셀/EV 특성화</td></tr></tbody></table>

키메라 항원 수용체-세포외 소포(car-ev) 기술 강화: 암 치료의 미래

Enhancing Chimeric Antigen Receptor-Extracellular Vesicles (CAR-EV) Technology: The Future of Cancer Therapy

CAR T/NK 세포 배양에 이어 EV 분리, 특성화 및 기능적 분석에서 EV 활용의 일반적인 워크플로우가 그림 1에 나와 있습니다. CAR T/NK 세포 배양에서 CM을 수집하고, EV 농축 및 다운스트림 특성화(나노입자 추적 분석 포함) 및 멀티웰 플레이트 MTS 분석을 통해 기능적 활성을 평가하기 전에 수집됩니다(그림 1).
GFP 태그가 부착된 CAR 세포는 현미경을 통해 시각화하여 배양에서 CAR 구조물의 발현을 확인할 수 있습니다. 현미경 검사는 충분한 형질도입 효율을 보장하기 위해 CM 수집 전과 수집 중에 일상적인 단계로 수행되어야 합니다. 효율성을 평가할 때 잠재적인 자가형광을 포착하기 위해 명시야 및 GFP 채널을 오버레이하는 것이 중요합니다. 주목할 점은 T 세포가 자연적으로 뭉치는 경향이 있으며(NK 세포에서도 유사하게 관찰됨, 데이터는 표시되지 않음), 세포가 응집된 표현형을 나타낼 때 형광을 명확하게 관찰할 수 있다는 것입니다(그림 2).
EV 농축 후 EV는 NTA 및 웨스턴 면역블로팅을 통해 특성화될 수 있습니다. NTA를 사용하여 입자 수율 분석을 통해 CM에 비해 분리된 EV에서 농도가 증가했음을 확인할 수 있습니다(그림 3A). 웨스턴 블롯 데이터는 CAR 세포 및 EV에서 세포용해 마커 그랜자임 B의 발현과 후자에서 칼넥신의 부재를 추가로 확인하여 제제에 세포 물질이 없음을 확인합니다. HEK293T 세포는 CAR 음성 대조군으로 포함됩니다(그림 3B).
세포 생존력/증식 능력을 결정하기 위해 MTS 분석을 통해 EV 기능 분석을 수행했습니다. MCF-7 유방암 및 K562 혈액암 세포 생존력 및 성장에 대한 EGFR 및 HER2 표적 CAR-EV의 효과는 490nm의 흡광도(배경 신호 제거 후)에서 비색 MTS 시약을 측정하여 결정됩니다. 이 예에서 CAR-EV를 표적으로 하는 EGFR은 MCF-7 및 K562 세포 생존력을 각각 70% 및 40% 감소시켰습니다. CAR-EV를 표적으로 하는 HER-2는 MCF-7을 ~10% 감소시켰습니다(스튜던트 t-테스트를 통해 결정됨). 실험 레이아웃을 고려할 때 비모수 테스트(예: Mann-Whitney U)를 사용하면 후속 연구에서 보다 강력한 통찰력을 제공할 수 있습니다(그림 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig1.jpg"> 
그림 1: CAR-EV 생성, 강화, EV 특성화 및 기능 판독. 기능 분석 전에 강화된 CAR-EV 샘플의 EV 생성, 생산 및 특성화의 일반적인 워크플로를 보여주는 개략도입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig2.jpg"> 
그림 2: HER2 표적 CAR-T 세포에서 GFP 발현 확인에 의한 대표적인 현미경 분석. 이미지는 20x 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경 을 통해 캡처되었습니다. 흰색 스케일 바는 50μm의 길이를 나타냅니다. T 세포는 단일 세포로 분리되기 전에 덩어리로 성장하는 자연스러운 경향이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig3.jpg"> 
그림 3: CAR 세포 및 EV의 특성화. (A) CAR-T CM 및 농축된 EV의 나노 추적 입자 분석. EV의 입자 농도는 CM보다 1.6-2.1배 더 높았고, 단백질 농도는 &gt;80% 감소했습니다. 통계적으로 유의미한 차이는 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 테스트로 테스트되었습니다. 피≤ 0.001, **** 피≤ 0.0001. (B) 형질도입된 T 세포 및 농축된 CAR-EV의 웨스턴 블롯 분석은 CAR 세포와 EV 모두에서 세포용해성 그랜자임 B의 존재를 확인한 반면, HEK293T 비-CAR 세포에서는 부재가 나타났습니다. 칼넥신은 CAR-EV에서 검출되지 않았으며, 이는 소포체 입자에 의한 오염이 적다는 것을 나타냅니다. 레인당 단백질 부하 = 5μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig4.jpg"> 
그림 4: 표적 세포 생존력(MCF-7 유방암 세포 및 K562 만성 골수성 백혈병 세포주)에 대한 CAR-EV의 효과. 표적 세포를 최대 3일 동안 4.5 x 105 및 2.5 x 105 EVs/세포(각각 EGFR 또는 HER2 CAR) 또는 대조군(EV 완충액)의 단일 용량으로 처리했습니다. (A) EGFR 표적 CAR-EV 세포. (B) HER2 표적 CAR-EV. 흡광도 판독값(치료 효능을 나타냄)의 감소가 두 세포주 모두에서 관찰되었습니다. 데이터는 양측 짝이 없는 스튜던트 t-테스트를 사용하여 분석된 SD(n = 3)± 평균 흡광도를 나타내며 p-값은 통계적 유의성을 나타냅니다. ** 피≤ 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

키메라 항원 수용체-세포외 소포(CAR-EV) 기술 강화: 암 치료의 미래

CAR cell therapies have significantly advanced personalized treatment for several hematological malignancies. Currently, seven CAR-&#8239;cell products ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생체 외에서 제조하는 기술을 보여줍니다. 인간 T 세포는 인터루킨-2(IL-2)가 보충된 배지와 함께 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 비드로 배양되어 T 세포의 활성화 및 증식을 유도합니다. 형질전환 렌티바이러스 벡터가 도입되어 형질전환 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 전이유전자를 발현할 수 있습니다. 그 결과 형질도입된 T 세포가 표면에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현합니다. T 세포는 CAR 발현 및 동결 보존을 평가하기 위해 정의된 시점에 수확됩니다.

키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 생체 외 기술

이 비디오는 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생체 외 생성 기술을 보여줍니다. 형질전환 RNA를 운반하는 레트로바이러스 벡터는 인터루킨-2가 보충된 배지에서 비장 세포와 혼합되어 T 세포의 생존과 증식을 촉진합니다. 그런 다음 혼합물을 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트로 옮기고 원심분리하여 바이러스와 세포의 융합을 촉진함으로써 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 종양 항원을 표적으로 하는 표면 결합 CAR을 생산할 수 있도록 합니다.

종양 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하기 위한 생체 외 기술

화학요법 및 방사선 표준 치료의 림프구 정지 및 면역 조절 효과를 활용하여 T 세포 면역 요법의 항종양 효능을 향상시킬 수 있습니다. EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하고 교모세포종 표준 치료의 맥락에서 투여하는 방법을 설명합니다.

배려의 아교 모세포종 표준의 맥락에서 입양 치료에 대한 자동차 T 세포의 생성

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 쥐 T 세포 transduction을 간소화하여 마우스 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 촉진합니다.

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

이 프로토콜은 암 면역 요법을 위한 비통합 mRNA를 사용하여 일시적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 자세한 절차를 설명하고 CAR-T 세포 및 세포 독성 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

이 프로토콜은 mRNA 전기천공에 의한 일차 T 세포의 분리, 활성화, 증식, 일시적 형질전환 등 원차 T 세포 배양의 필수 단계를 설명합니다. 또한, 표현형, 활성화 마커, 생존 가능성 및 키메라 항원 수용체(CAR) 발현의 유동 세포 분석을 위한 워크플로우 및 항체 패널도 제안됩니다.

1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법

특정 사이트 recombinase (SSR) 기술과 Cre 호텔 / 훈제 연어 시스템의 출현은 분자 생물학에 많은 발전을 주도하고, 유전자 변형 동물의 유전자 기능을 평가하기위한 유용한 도구로 자신을 증명되었습니다. 이 인터뷰는 Cyclization recombinase (Cre 호텔) 방법과이 효소의 사용이 전략을 밖으로 전통 노크에 비해 상당한 장점을 가지고 조건부 돌연변이 유발의 개발 하였다하여 사이트 특정 재조합의 메카니즘을 설명합니다.

특정 사이트 Recombinase (SSR) 기술의 원리

학습하세요 CAR-EV 기술을 활용한 암 치료법으로, 이온 교환 크로마토그래피로 고순도 CAR-EV를 분리하고 나노입자 추적 분석으로 특성을 분석합니다. 이 방법은 고형 종양 및 염증성 질환에 대한 RNA 치료제 전달을 위한 세포 없는 표적 치료 전략을 제공합니다.

키메라 항원 수용체-세포외 소포(CAR-EV) 기술 강화: 암 치료의 미래

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