키메라 항원 수용체-세포외 소포(CAR-EV) 기술 강화: 암 치료의 미래

우리의 연구는 엑소좀 기반 진단 및 치료법 개발에 중점을 두고 있습니다. 부수종양 치료를 위해 세포 기반 치료법보다 더 안전하고 효과적이며 접근성이 높은 키메라 항원 수용체 엑소좀 기반 치료제를 개발하는 것이 목표입니다. 당사의 EXO-NET 및 EXO-ACE 플랫폼은 높은 수율과 순도로 확장 가능하고 재현 가능하며 GMP를 준수하는 엑소좀 분리를 가능하게 하여 연구 및 치료에 대한 기존 방법의 한계를 해결합니다.

EXO_NET net과 EXO-ACE는 연구, 진단 및 치료 응용 분야에서 우수한 순도와 재현성으로 신속하고 확장 가능하며 GMP를 준수하는 EV 분리를 가능하게 합니다. 우리는 CAR-EV를 엔지니어링하고 차세대 무세포 표적 치료제를 제공하기 위해 빠르고 확장 가능하며 검증된 방법을 개발했습니다. 이는 임상적으로 필요한 다른 질병 상태에 적용할 수 있는 강력한 워크플로를 제공합니다.

우리의 다음 목표는 고형 종양 및 기타 염증성 질환 치료를 위한 RNA 치료제 전달을 위한 CAR-EV를 생성하기 위해 개발하고 검증한 방법을 사용하는 것입니다. 시작하려면 이온 교환 컬럼을 15분 동안 똑바로 세워 실온으로 가져옵니다. 피펫을 사용하여 10 컬럼 부피의 재생 완충액을 추가한 다음 10 컬럼 부피의 평형 완충액을 추가합니다.

THOD 컨디셔닝 배지를 0.22마이크로미터 폴리에테르설폰 필터에 통과시킵니다. 이제 여과된 샘플의 최대 31.2 컬럼 부피를 평형 컬럼에 추가합니다. 그런 다음 10 컬럼 부피의 세척 완충액을 추가한 다음 2.5 컬럼 부피의 용출 완충액을 추가합니다.

농축된 세포외 소포를 포함하는 흐름을 수집합니다. 30킬로달톤 한외여과 원심 필터와 희석제를 사용하여 세포외 소포 용리액에 완충액 교환을 수행하여 최소 100배 희석을 보장합니다. 실험적 필요에 따라 교환된 용액의 최종 부피를 조정합니다.

농축된 세포외 소포 샘플을 0.22마이크로미터 필터에 통과시켜 시험관 내 분석을 위해 멸균합니다. 나노입자 추적 분석을 사용하여 CAR 세포외 소포의 크기 분포, 농도 및 수율을 결정합니다. 고처리량 판 엑소좀 세포외 소포 분리를 위해 기기를 켜고 로그인하십시오.

HT EV 단백질 분리 프로토콜을 설정하도록 설정을 구성합니다. 팁 빗을 96웰 딥웰 플레이트에 넣어 팁 빗 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 PBS 1밀리리터를 추가하여 3개의 세척 플레이트를 준비합니다.

이제 35마이크로리터의 1%SDS 완충액을 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하여 용출 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 컨디셔닝된 배지 1밀리리터를 추가하여 결합판을 준비합니다. 자동 분리 시스템에서 HT EV 단백질 분리 프로토콜 프로그램을 선택하여 프로토콜을 시작하고 재생 버튼을 선택합니다.

기기를 열어 플레이트 로드를 시작합니다. 기기의 지시에 따라 준비된 용출 플레이트를 로드한 다음 3회 세척 딥웰 플레이트를 기기에 로드합니다. 결합 플레이트를 로딩하기 직전에 30마이크로리터의 팬 엑소좀 캡처 비드를 각 웰에 추가합니다.

바인딩 플레이트를 기기에 넣은 다음 팁 빗 플레이트를 로드하고 기기를 닫아 바인딩을 시작합니다. 이 시스템은 컨디셔닝된 배지 샘플과 마그네틱 비드를 30분 동안 저속으로 지속적으로 혼합하여 세포외 소포의 효율적인 포획을 촉진합니다. 결합 단계가 완료되면 시스템이 30초 동안 느린 속도로 혼합하여 비특이적 오염 물질을 제거하는 세 가지 세척 단계를 수행합니다.

자동화 시스템이 30초 동안 바닥 혼합을 수행하여 단백질 회수를 위해 세포외 소포 용해를 시작할 수 있도록 합니다. 배양하는 동안 기기는 피펫 팁을 각 웰 위에 유지하면서 7분 30초 동안 일시 중지됩니다. 또 다른 30=초 믹스를 시작한 다음 7분 30초 동안 다시 일시 중지합니다.

프로토콜이 종료되면 시스템은 사용한 팁 빗을 들어 올려 96웰 플레이트에 용액을 남기고 팁에 부착된 마그네틱 비드를 남깁니다. 마지막으로 기기는 탈퇴 단계로 진행하여 팁 빗을 팁 빗 플레이트로 되돌립니다. 기기를 열고 플레이트를 제거합니다.

GFP 형광은 형질도입된 T 세포에서 CAR 발현을 확인했으며, 세포 클러스터에서 국소화가 분명했으며 명시야 및 GFP 채널을 오버레이하여 공국소화가 확인되었습니다. 나노입자 추적 분석은 EGFR 및 HER2 CAR 구조체 모두에 대해 조절된 배지에 비해 농축된 EV 분획에서 세포외 소포의 농도가 상당히 높은 것으로 나타났습니다. 웨스턴 블로팅은 CAR 발현 세포와 분리된 세포외 소포에서 그랜자임 B의 존재를 확인했으며, 세포외 소포에는 칼넥신이 없어 세포 오염이 없음을 나타냅니다.

EGFR 표적 CAR 세포외 소포는 MCF-7 유방암 세포 생존력을 70%, K-562 혈액암 세포 생존력을 40% 유의하게 감소시켰습니다 HER2 표적 세포외 소포는 MCF-7 유방암 세포 생존력을 약 10% 감소시켰지만 K-562 혈액암 세포에는 관찰 가능한 효과가 없었습니다.