Name: 종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 학습하세요 종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 생체 내 재프로그래밍하는 방법을. PU.1, IRF8, BATF3 전사 인자를 이용하여 면역 냉각 종양을 면역 가열 상태로 전환하고 항종양 면역을 유도합니다.

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<ol><li>Oliveira, G., Wu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+specificities+of+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).</li>
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<li>Adams, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+monotherapy+for+previously+untreated%2C+PD-L1-positive%2C+metastatic+triple-negative+breast+cancer%3A+cohort+B+of+the+phase+II+KEYNOTE-086+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study.</a> Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+trial+of+trifluridine%2Ftipiracil+plus+nivolumab+in+patients+with+heavily+pretreated+microsatellite-stable+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).</li>
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<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
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<li>Theisen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDFY4+is+required+for+cross-presentation+in+response+to+viral+and+tumor+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens.</a> Science. 362 (6415), 694-699 (2018).</li>
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<li>Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-residing+Batf3+dendritic+cells+are+required+for+effector+T+cell+trafficking+and+adoptive+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy.</a> Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).</li>
<li>Hubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-III+is+selectively+produced+by+cDC1+and+predicts+good+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer.</a> Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).</li>
<li>Mahadevan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+conventional+dendritic+cells+facilitate+immunotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer.</a> Science. 384 (6703), eadh4567(2024).</li>
<li>Ascic, E., Pereira, C. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).</li>
<li>Silk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+tumour+antigens+by+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+CD141%2B+XCR1%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells.</a> Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).</li>
<li>Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+generation+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and generation of human dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).</li>
<li>Makino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cDC-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).</li>
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<li>Ascic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+cell+reprogramming+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy.</a> Science. 386 (6719), eadn9083(2024).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+informs+efficient+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+cross-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).</li>
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<li>Bouquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RapaCaspase-9-based+suicide+gene+applied+to+the+safety+of+IL-1RAP+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells.</a> Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+primary+human+fibroblasts+with+only+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).</li>
<li>Rojas, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+RNA+neoantigen+vaccines+stimulate+T+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer.</a> Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).</li>
<li>Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cancer+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells.</a> Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).</li>
<li>Cabrita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+lymphoid+structures+improve+immunotherapy+and+survival+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma.</a> Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+endogenous+retroviruses+promote+lung+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy.</a> Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.45 & 무; m 저단백 결합 필터, 150mL 병뚜껑 진공 필터</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>15983297</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 50mM</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>항마우스 CD45 단클론 항체(클론: 30-F11), 쥐 IgG2b, &kappa;</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>나6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl(CD45.1)</td><td>잭슨 연구소</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD 마이크로 파인 U-100 인슐린 주사기 (0.5 mL)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>11395751</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>콜라게나제 D</td><td>시그마 알드리치</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브와 함께 사용하기 위한 Corning Falcon 셀 스트레이너</td><td>시그마 알드리치</td><td>CLS352340</td><td></td></tr><tr><td>코닝 커버 안경 24 x 50mm&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 이염산염)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마 알드리치</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 고정 가능한 생존 가능성 염료 eFluor 450</td><td>인비트로젠</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience IHC 항원 회출 용액 - 낮은 pH(10x)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>00-4955-58</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 마운팅 매체</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>GFP 항체 [Alexa Fluor 594]</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NB600-308AF594</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM/영양 혼합물 F-12 (DMEM/F-12)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM 비필수 아미노산 용액 (100x)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 중간</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 피루빈산 나트륨 (100 mM)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 트리판 블루 용액, 0.4%</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 보충제&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>염소 항쥐 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, 다클론, Alexa Fluor 488</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 세포</td><td>ATTC</td><td>CRL-11268 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>헥사디메트린 브롬화물(폴리브렌)</td><td>시그마 알드리치</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>하이클론 덜베코의 고포도당 변형 이글 배지(DMEM)</td><td>사이티바</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 페니실린 스트렙토마이신 100x 용액(펜/연쇄상구균)</td><td>사이티바</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>사이티바</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>케타미놀 수의사. 주사용 용액 100 mg/mL</td><td>MSD Animal Health 스웨덴</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드 - C35</td><td>PFM 의료</td><td>207500005</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항-CD45.2 (104), 표면, APC, 단클론</td><td>바이오레전드</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항-MHCII(M5/114.15.2), 표면, PE-Cy7, 단클론</td><td>바이오레전드</td><td>107630</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 세럼</td><td>아브캠</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>일반 쥐 혈청(멸균)</td><td>아브캠</td><td>AB7488</td><td></td></tr><tr><td>오픈 탑 얇은 벽 폴리프로필렌 튜브</td><td>Beckman Coulter 생명 과학</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 16% w/v aq. soln., 메탄올 무함유</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>043368.9엠</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Batf3, 모노시스트로닉 카세트 인코딩 마우스 Batf3</td><td>아드진</td><td>139837</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Irf8, 모노시스트로닉 카세트 인코딩 마우스 Irf8</td><td>아드진</td><td>139838</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Pu.1, 모노시스트로닉 카세트 인코딩 마우스 Pu.1</td><td>아드진</td><td>139839</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 pMD2.G</td><td>아드진</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 psPAX2</td><td>아드진</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 SFFV-eGFP(eGFP)</td><td>사내 복제</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 SFFV-mCherry (mCherry)</td><td>사내 복제</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 SFFV-PIB-eGFP,&nbsp; 마우스 PU.1, IRF8 및 BATF3(PIB)&nbsp를 암호화하는 폴리시스트로닉 카세트;</td><td>사내 복제</td><td>-</td><td>재프로그래밍에 사용되는 구조 및 벡터는 회사와의 재료 이전 계약에 따라 Asgard Therapeutics에서 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>폴리에틸렌민(PEI), 선형, MW 25000, 형질감염 등급</td><td>폴리사이언스</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes 소수성 배리어 Pap Pen</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>부티르산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 접착 현미경 슬라이드</td><td>에프레디아</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>티슈텍 O.C.T. 컴파운드</td><td>사쿠라 파인텍</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 효소 (1x) 페놀 레드 없음</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>TT Cryomold Intermediate, 정사각형(15 x 15 x 5 mm)</td><td>사쿠라 파인텍</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>울트라퓨어 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>인비트로젠</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>자이솔 수의사. 주사용 용액 20 mg/mL</td><td>VM 제약</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>YUMM1.7 세포</td><td>안티네오</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍

Tractable In Vivo Reprogramming of Tumor Cells to Type 1 Conventional Dendritic Cell-like Cells

다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍 프로토콜의 개략적 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 먼저, 우리는 cDC1 지시 재프로그래밍 인자 PU.1, IRF8, BATF3을 암호화하는 폴리시스트론 렌티바이러스 벡터 SFFV-PIB-IRES-eGFP(PIB-eGFP)를 생산한 다음 HEK 293T 패키징 세포주에서 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 생산했습니다. 렌티바이러스 매개 면역원성을 제어하기 위해 다중 클로닝 부위(MCS) 및 IRES-eGFP를 포함하지만 재프로그래밍 인자를 제외한 빈 SFFV-MCS-eGFP(eGFP) 벡터를 생산했습니다. 바이러스 생산 후, 우리는 렌티바이러스 함유 상청액을 수확하고 초원심분리에 의해 농축했습니다. 우리는 형질도입(eGFP+)과 형질도입되지 않은(eGFP-) 세포의 1:1 비율을 달성하는 데 필요한 양을 결정하기 위해 바이러스를 기능적으로 적정했으며, 이는 형질도입 후 3일째에 평가했습니다. 그런 다음 생성된 바이러스 양을 사용하여 -1일에 선택된 암세포주를 형질도입했습니다. 24시간 후, 세포를 채취하여 피하에 이식하여 종양을 확립했습니다. 이 전략은 형질도입된 세포가 TME 내에서 생체 내에서 cDC1 유사 세포로 재프로그래밍되도록 보장했습니다. 생착 후 표시된 시점에서 생체 내 재프로그래밍 효율을 정량화하기 위해 해리된 종양 세포의 유세포 분석을 포함한 다운스트림 분석을 위해 종양을 절제 및 처리하거나 TME의 변화를 특성화하기 위해 동결 보존된 종양 절편의 면역형광 염색을 포함했습니다.
첫째, 높은 렌티바이러스 역가의 생산을 보장하기 위해 형질감염 전에 HEK 293T 세포를 모니터링하여 70-80% 컨플루언에 도달하는 것을 목표로 하고 24시간 후 형광 현미경에 의한 eGFP 발현을 통해 형질감염 효율을 평가했습니다(그림 2A). 다음으로, 형질감염 후 48시간 및 60시간에 바이러스 함유 배지를 수집하여 초원심분리한 후 -80°C에서 분취량으로 보관했습니다(그림 2B). 그런 다음 YUMM1.7 흑색종 세포에서 eGFP+ 대 eGFP- 세포의 1:1 비율을 달성하는 데 필요한 최적의 바이러스 양을 결정했습니다. 6웰 플레이트에 웰당 10개의5 YUMM1.7 세포를 파종하고, 렌티바이러스의 부피를 증가시키는 세포를 형질도입하고, 24시간 후에 바이러스 함유 상청액을 신선한 DMEM/F12 완전 배지로 대체했습니다(그림 2C). 3일째에 우리는 유세포 분석을 통해 eGFP+ 세포의 정확한 백분율을 정량화하기 전에 형광 현미경으로 eGFP 발현을 평가했습니다(그림 2C). eGFP+ 와 eGFP- 세포의 비율을 정량화하기 위해 살아있는 단일 세포에서 죽은 세포와 이중항을 배제하기 위해 게이팅했습니다(그림 2D). 생산된 렌티바이러스 배치의 최적 부피는 PIB-eGFP 및 대조군 eGFP 바이러스 모두에 대해 105 YUMM1.7 세포당 2 μL로 결정되었으며, 그 결과 각각 50.0 ± 0.3% 및 63.0 ± 0.9% eGFP+ 세포가 생성되었습니다(그림 2E).
다음으로, 생체 내 재프로그래밍 효율을 평가하기 위해 형광 표지(mCherry+) 암세포주(YUMM1.7-mCherry)를 생성했습니다. 이를 통해 유세포 분석에서 살아있는 mCherry+ 세포를 게이팅하여 암세포와 간질 또는 면역 세포를 구별할 수 있었습니다(그림 3A,B). 그런 다음 105개 세포당 2μL의 PIB-eGFP 또는 대조군 eGFP 바이러스로 YUMM1.7-mCherry 세포를 형질도입하여 1:1 eGFP+ 대 eGFP- 비율을 달성했습니다. CD45.1 마우스의 종양당 1.6 × 106개 세포를 피하 이식하고 비교를 위해 시험관 내에서 배양할 세포의 분취량을 유지했습니다. 우리는 eGFP 또는 mCherry를 삼킨 숙주 면역 세포를 배제하기 위해 살아있는 mCherry+ eGFP+ 및 CD45.1- 세포를 게이팅하는 유세포 분석을 통해 재프로그래밍 효율성을 평가했습니다(그림 3B). 1일에서 9일까지, 우리는 부분적으로 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포(CD45.2+ MHC-II- 또는 CD45.2- MHC-II+) 및 완전히 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포(CD45+ MHC-II+)를 표시하는 CD45.2 및/또는 MHC-II 발현의 점진적인 획득을 관찰했습니다(그림 3C). 우리는 생체 내 마우스 암세포의 재프로그래밍이 시험관 내 조건에 비해 9일째에 cDC1 유사 세포의 비율이 더 높다는 것을 검증했습니다(9.54 ± 1.54% CD45+ MHC-II+ in vivo 대 4.72 ± 1.1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0.018). 재프로그래밍의 동역학은 또한 4일째에 더 높은 비율의 cDC1 유사 세포를 관찰함에 따라 가속화되었습니다(8.7 ± 3.3% CD45+ MHC-II+ in vivo 대 0.3 ± 0.1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0.05), 환경 단서의 존재가 cDC1 유사 세포에 대한 더 빠르고 효율적인 재프로그래밍을 촉진함을 나타냅니다19. 시험관 내에서 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포는 15일까지 존재했지만, 생체 내 cDC1 유사 세포는 9일 동안 지속되었지만 15일까지 검출되지 않았으며, 이는 숙주 면역 체계에 의한 TME의 고갈을 시사합니다(그림 3C). 
마지막으로, 우리는 처음 9일 동안 생체 내 cDC1 재프로그래밍의 결과로 TME의 초기 변화를 특성화하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 범조혈 마커 CD45로 표시된 면역 세포의 침윤에 초점을 맞춰 생체 내 재프로그래밍 3일 및 9일 후 eGFP 및 PIB-eGFP 종양 모두에서 동결 보존 및 절편된 종양 조직의 면역형광 염색을 수행했습니다. 특히, cDC1 유사 세포는 eGFP 종양(49.6 ± 17.0 대 8.0 ± 5.8 종양 영역당 CD45 염색의 eGFP 평균 형광 강도; 그림 4A,B). 흥미롭게도 우리는 생체 내 재프로그래밍 9일 후 종양의 TME 내에서 TLS를 검출했습니다. 이는 cDC1 유사 세포가 3일 이내에 TME를 "면역 감기" 환경에서 "면역 온성" 환경으로 빠르게 리모델링할 수 있으며, 이는 이후 9일째에 TLS 형성으로 이어질 수 있음을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig1.jpg"> 
그림 1: 암세포의 생체 내 재프로그래밍에 의해 cDC1 유사 세포를 생성하기 위한 프로토콜 개요. 비장 초점 형성 바이러스 프로모터(SFFV)의 제어 하에 폴리시스트로닉 카세트에 PU.1, IRF8 및 BATF3을 암호화하는 렌티바이러스 벡터 SFFV-PIB-IRES-eGFP는 유세포 분석 및 형광 현미경으로 형질도입된 세포를 추적하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 후 HEK 293T 패키징 세포주에서 생산됩니다. 그런 다음 렌티바이러스 벡터를 초원심분리하고 기능적으로 적정하여 형질도입된 eGFP+ 와 형질도입되지 않은 eGFP- 세포의 비율로 암세포를 형질도입하는 데 필요한 바이러스의 양을 결정합니다. 생체 내 재프로그래밍 실험을 위해 암세포는 -1일에 최적의 양의 렌티바이러스로 도금됩니다. 다음날, 형질도입된 GFP+ 와 형질도입되지 않은 GFP- 세포의 1:1 혼합물을 세척하고 마우스의 피하 종양 형성을 위해 수집합니다. 유세포 분석법에 의해 3일째에 형질도입을 검증하기 위해 병렬 시험관 내 배양이 유지됩니다. 동물은 종양 성장과 생존을 위해 2-3일마다 모니터링됩니다. 종양은 정의된 시점에서 수집되고 유세포 분석을 위한 표면 마커 발현을 위해 해리 및 염색됩니다. 또는 면역형광 염색 및 공초점 현미경 분석을 위해 전체 조직을 고정, 냉동 보존 및 절편합니다. 생체 내 재프로그래밍 효율은 유세포 분석 분석으로 평가되는 반면, 종양 미세 환경의 변화는 공초점 이미징으로 특징지어집니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig2.jpg"> 
그림 2: 생체 내 cDC1 재프로그래밍 을 위한 렌티바이러스의 생산 및 기능적 적정.(A) HEK 293T 세포가 ~70-80% 합류에 도달하면, 7.5μg의 psPAX2, 2.5μg의 mPD2.G 및 60μL의 1mg/mL PEI와 함께 SFFV-PIB-eGFP(PIB-eGFP) 또는 빈 렌티바이러스 벡터 대조군 SFFV-eGFP(eGFP) 중 10μg의 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 형질감염됩니다. 형질감염 후 24시간 동안 eGFP 발현을 보여주는 HEK 293T 세포의 명시야 및 형광 현미경 이미지는 성공적인 플라스미드 전달을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. (B) 렌티바이러스를 농축하기 위한 초원심분리 워크플로우의 개략도. HEK 293T 세포의 렌티바이러스 함유 상청액을 형질감염 후 48시간 및 60시간에 수집하고, 0.45μm의 저단백 결합 PES 필터를 통해 여과하고, 벤치 스케일을 사용하여 개방형 상판 박막 폴리프로필렌 튜브에서 37g을 계량합니다. 튜브를 Swinging-Bucket Rotor에서 초원심분리하고 상청액을 흡인하고 펠릿을 5분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 펠릿을 HEPES를 함유한 얼음처럼 차가운 DMEM에 재현탁하고 밤새 배양한 후 분취하여 -80°C에서 보관합니다. (C) GFP+ 대 GFP- 세포의 1:1 비율을 달성하기 위한 최적의 바이러스 용량을 결정하기 위한 기능적 적정의 실험적 전략. 형질도입 후 72시간 후에 YUMM1.7 흑색종 세포에서 eGFP 발현을 보여주는 명시야 및 형광 현미경 이미지는 재프로그래밍 인자 및 eGFP의 성공적인 전달을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. (D) eGFP+ 세포의 비율을 정량화하기 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯. 살아있는 세포는 생존율 염료 음성 집단(DAPI)에 대해 게이팅된 후 이중 배제되었습니다. (E) 1:1 GFP+/GFP- 세포를 달성하기 위한 최적의 부피를 결정하기 위해 바이러스 용량을 증가시키면서 형질도입 효율의 유세포 분석 정량화. PIB-eGFP 및 eGFP 렌티바이러스 모두에 대해 105 개 세포당 2 μL 부피가 원하는 비율을 달성했습니다. 약어: cDC1s = 유형 1 기존 수지상 세포; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; PIB = PU.1, IRF8 및 BATF3; PEI = 폴리에틸렌니민. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig3.jpg"> 
그림 3: 생체 내 cDC1 재프로그래밍 효율성 평가. (A) 생체 내 cDC1 재프로그래밍 효율을 평가하기 위한 실험 워크플로의 개략도. 암세포는 처음에 mCherry를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입되어 형광 표지 세포주(YUMM1.7-mCherry)를 생성한 후 -1일에 최적화된 용량의 PIB-eGFP 렌티바이러스로 형질도입됩니다. 그런 다음 0일에 세포를 1:1 비율의 eGFP+/eGFP- 세포로 피하 주사하여 CD45.1 마우스에서 종양을 확립하고 PIB 형질도입 세포가 TME 내에서 cDC1 유사 세포로 재프로그래밍되도록 합니다. 그런 다음 종양을 지정된 시점에서 분리하고, 해리하고, 유세포 분석을 사용하여 CD45.1, CD45.2 및 MHC-II에 대해 염색합니다. 이를 통해 CD45.1 숙주 면역 세포를 배제하여 CD45.2 및 MHC-II의 발현에 의한 생체 내 cDC1 재프로그래밍 효율을 정량화할 수 있습니다. 병렬 시험관 내 배양은 생체 내 재프로그래밍과 비교하기 위해 시점 전반에 걸쳐 유지됩니다. (B) 9일째의 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯. 성공적으로 형질도입된 암세포를 식별하기 위해 mCherry+ 및 GFP+에서 세포를 게이팅했습니다. 숙주 면역 세포는 CD45.1+ 세포를 게이팅하여 제외되었습니다. (C) 유세포 분석법에 의한 YUMM1.7-mCherry 세포의 생체 내 재프로그래밍 효율(왼쪽)을 eGFP+ mCherry+ 내에서 게이팅된 CD45+ MHC-II+ 세포(완전히 재프로그래밍됨) 및 CD45.2+ HLA-DR- 또는 CD45.2- HLA-DR+ cDC1 유사 세포(부분적으로 재프로그래밍됨)의 백분율로 정량화합니다. 셀. 표시된 시점 동안 PIB-eGFP 형질도입된 YUMM1.7-mCherry 세포에서 CD45.2 및 MHC-II 발현의 점진적인 획득을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯(오른쪽). eGFP형질도입된 YUMM1.7-mCherry 세포를 대조군으로 사용하였고, 비교를 위해 시험관 내에서 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포를 사용하였다. (C)의 데이터는 3-5개의 생물학적 복제 실험의 평균 ± SD를 나타냅니다. (C)의 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 CD45+ MHC-II+ 세포에 대해 수행되었습니다. *P &lt; 0.05. 약어: cDC1s = 유형 1 기존 수지상 세포; PIB = PU.1, IRF8 및 BATF3; TME = 종양 미세 환경. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig4.jpg"> 
그림 4: 생체 내 cDC1 재프로그래밍 후 종양 미세 환경에서 면역 침윤 분석. (A) 3일 및 9일에 PIB-eGFP- 또는 대조군 eGFP-형질도입 세포(형질도입된 세포와 부모 세포의 1:1 비율)를 피하 이식한 후 YUMM1.7 종양에서 CD45+ 세포를 보여주는 대표적인 공초점 이미지. 스케일 바 = 500 μm. (B) 3일 및 9일에 PIB 처리 및 대조군 eGFP 형질도입 YUMM1.7 종양에서 CD45 염색을 위한 MFI의 정량화. (B)의 데이터는 3-6개의 생물학적 복제 실험의 평균 ± SD를 나타냅니다. (B)의 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 수행되었습니다. *P &lt; 0.05 및 ***P &lt; 0.001. 약어: cDC1s = 유형 1 기존 수지상 세포; PIB = PU.1, IRF8 및 BATF3; MFI = 평균 형광 강도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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