종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍

이 프로토콜은 전사 인자 PU.1, IRF8 및 BATF3의 강제 발현을 통해 마우스 암세포를 종양 미세 환경 내에서 유형 1 수지상 유사 세포로 생 체 내 재프로그래밍하는 것을 설명합니다.

우리는 새로운 면역 요법 전략으로 암세포를 cDC1 유사 세포로 생체 내 프로그래밍하는 것을 조사합니다. 우리는 이 접근법이 면역 냉성 종양을 면역 온성으로 전환하여 항종양 면역을 발표할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로 합니다. 우리는 암세포를 종양 내에서 직접 면역원성 cDC1 유사 세포로 전환하는 프로토콜을 제시함으로써 현재 생체 내 cDC1 생성 전략의 한계를 해결하여 cDC1 구동 면역 반응을 제자리에서 연구할 수 있게 합니다.

당사의 다루기 쉬운 생체 내 프로그래밍 프로토콜은 억제된 종양 미세 환경을 극복하여 성숙한 면역원성 cDC1 유사 세포를 안정적으로 생성하며, 이러한 세포는 생체 내에서 직접 생성되기 때문에 이 접근법은 시험관 내 면역 세포 제조의 필요성을 제거합니다. 우리의 연구 결과는 생체 내 전사 인자 매개 재프로그래밍을 임상으로 전환하기 위한 기반을 구축하여 내구성 있는 항종양 면역 반응을 유도하는 기성품이지만 개인화된 암 면역 요법을 도입합니다. 앞으로 우리는 cDC1 유사 세포 재프로그래밍이 어떻게 3차 및 인프라의 형성을 유도할 수 있는지, 그리고 이것이 체액성 면역으로 전환되는지 여부를 조사하고 있습니다.

또한 우리는 다른 면역 치료 접근법과의 잠재적인 시너지 효과도 탐구하고 있습니다. 시작하려면 HEK 293T 세포가 70-80% 융합성에 도달할 때까지 배양합니다. 이제 전이 플라스미드를 포함하는 준비된 형질감염 혼합물을 1분 동안 완전히 소용돌이치고 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양하여 DNA 지질 복합체가 형성되도록 합니다.

HEK 293T 세포에서 배지를 흡인하고 페니실린 스트렙토마이신이 없는 DMEM 10밀리리터를 첨가하고 10% FBS를 보충합니다. 그런 다음 형질감염 혼합물을 150mm 플레이트에 적가하고 5% 이산화탄소와 함께 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지를 1밀리몰 부티르산나트륨이 보충된 DMEM 완전 배지 20밀리리터로 교체하고 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 24시간 동안 배양합니다.

다음으로, 형질감염 후 48시간 및 60시간에 렌티바이러스 함유 상청액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다. 첫 번째 수집 후 두 번째 수확을 위해 150mm 플레이트당 12밀리리터의 예열된 완전 DMEM을 추가합니다. 0.45마이크로미터, 저단백질 결합 폴리에테르설폰 필터를 통해 수집된 액체를 여과합니다.

37g의 렌티바이러스 함유 배지를 38.5밀리리터 개방형 상단 얇은 벽 폴리프로필렌 튜브에 피펫팅합니다. 25, 000 G의 스윙 버킷 로터에서 튜브를 섭씨 4도에서 90분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다.

열린 상단의 얇은 벽 폴리프로필렌 튜브를 실험실 물티슈 또는 유사한 흡수성 재료 위에 거꾸로 놓아 여분의 액체를 배출하고 펠릿을 건조시킵니다. 다음으로, HEPES 또는 PBS가 보충된 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 DMEM을 각 펠릿에 첨가하고 혼합물을 50밀리리터 원추형 튜브에 놓인 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 완전한 재현탁을 허용합니다.

재현탁된 모든 펠릿을 단일 용기에 결합하고 바이러스 스톡을 50-200마이크로리터 사이의 더 작은 부피로 분취한 다음 장기간 사용을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 암세포 증식 후, 형질도입을 위해 세포 현탁액을 준비하여 3일째에 EGFP 양성 세포와 EGFP 음성 세포의 거의 1:1 비율을 달성합니다. 폴리브렌 밀리리터당 8마이크로그램을 세포 현탁액에 첨가한 다음 이전에 결정한 대로 적절한 양의 렌티바이러스를 첨가합니다.

거품이 생기지 않고 내용물을 부드럽게 섞습니다. 이제, 10의 10을 5개의 거듭제곱으로 함유한 준비된 세포 현탁액의 2밀리리터를 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 5%이산화탄소와 함께 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 각 웰에서 렌티바이러스 함유 배지를 제거합니다.

PBS로 우물을 두 번 세척합니다. 각 웰에 500마이크로리터의 트립신을 첨가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 5-10분 동안 배양합니다. 다음으로, 광학 현미경으로 웰을 검사하여 플레이트에서 세포가 완전히 분리되었는지 확인합니다.

그런 다음 완전한 배지를 사용하여 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다. 세포를 350G에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. PBS로 펠릿을 세척하십시오.

분취량을 취하고 혈구계와 트리판 블루 염색을 사용하여 생존 가능한 세포 수를 평가합니다. 다음으로, 최종 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁하여 종양당 50마이크로리터에서 6세포의 10의 1-2배에 해당하는 밀리리터당 7세포의 2배 10의 농도를 달성합니다. 세포를 얼음 위에 놓고 동물 실험 영역으로 이동합니다.

CD45.1 마우스를 마취한 후, 저체온증을 방지하기 위해 보온 패드 위에 올려 놓는다. 마취 중 안구 탈수를 방지하기 위해 마우스에 아이크림을 바르십시오. 면도기를 사용하여 마우스의 오른쪽 옆구리를 면도합니다.

선택적으로 귀 가기로 마우스를 표시합니다. 면도한 부위를 소독하고 70% 에탄올에 담근 면봉으로 남은 털을 제거합니다. 이제 P1000 피펫을 사용하여 암세포를 완전히 재현탁합니다.

완전히 재현탁된 세포 현탁액을 30게이지 바늘이 장착된 0.5밀리리터 주사기에 넣습니다. 두 손가락을 사용하여 면도한 마우스 옆구리의 피부를 부드럽게 들어 올리고 들어 올린 피부에 의해 형성된 주름에 주사기 바늘 끝을 삽입합니다. 한 손으로 주사기를 제자리에 고정한 상태에서 들어 올린 피부를 풀어줍니다.

다른 손을 사용하여 두 손가락으로 피부 윗부분을 늘립니다. 암세포 현탁액 50마이크로리터를 천천히 주입하여 주사 부위에 눈에 보이는 타원형 피하 부종을 만듭니다. 주사 절차 후 동물이 마취에서 완전히 깨어날 때까지 동물을 모니터링하여 생존을 보장합니다.

SFFV-PIB-eGFP 플라스미드로 형질감염된 HEK 293T 세포는 형질감염 후 24시간 동안 명확한 eGFP 발현을 보여 성공적인 혈장 전달을 확인했습니다. 형질도입 72시간 후, 흑색종 세포는 재프로그래밍 인자와 eGFP의 성공적인 전달을 나타냈습니다. 세포 이식 후 9일째에 생체 내 재프로그래밍은 시험관 내 조건보다 완전히 재프로그래밍된 CD45 양성, MHC-II 양성, cDC1 유사 세포의 비율이 더 높았습니다.

이식 후 3일째에 PIB-eGFP 종양은 eGFP 대조군보다 현저하게 더 높은 CD45 양성 면역 세포 침윤을 보였으며, 이는 조기 면역 리모델링을 나타냅니다. 9일째까지 종양 영역당 CD45 평균 형광 강도는 대조군보다 PIB-eGFP 종양에서 유의하게 더 높게 유지되었습니다. 3차 림프 구조는 9일째까지 PIB-eGFP 종양에서 검출 가능해졌으며, 이는 종양 미세 환경의 구조적 면역 변화를 나타냅니다.