SCAnED - 표피 및 진피 피부 구획에서 반자동 세포 및 핵 검출을 위한 오픈 소스 피부 분할 매크로

저희 연구에서는 분자, 세포, 구조, 기계적 수준에서 조직의 항상성을 유지하는 조절 메커니즘을 조사합니다. 저희의 목표는 피부 염증이나 암과 같은 병리적 상태를 이해하는 것입니다. 새로운 고해상도 영상 및 멀티오믹스 도구를 통해 우리는 이제 조직 내 세포 및 유전자 발현 변화를 2D 및 3D로 지도화할 수 있습니다.

이것은 질병이 어떻게 발생하고 진행되는지에 대한 우리의 이해를 크게 확장하고 있습니다. 현재 가장 큰 도전 중 하나는 첨단 현미경에서 생성되는 방대한 양의 데이터입니다. 이미지 분석을 위한 도구가 더 많아졌지만, 경험이 많지 않은 사람에게는 사용자 친화적이지 않거나 가격이 꽤 비싸는 경우가 많습니다.

저희 프로토콜은 표피와 진피 모두에서 인간 피부 세포를 분석할 수 있는 무료 사용자 친화적 도구를 제공합니다. 일반 도구보다 정확도를 높이며, 코딩이나 이미지 분석 경험이 필요하지 않습니다. 시작하려면, 기본 설정의 바이오 포맷으로 피지 또는 이미지 J에서 면역형광 이미지를 엽니다.

이 단계에서 채널을 분리하지 마세요. SCAnED 매크로를 다운로드해서 플러그인을 선택해서 실행하세요. 그다음 매크로와 실행 버튼을 누르세요.

SCAnED 매크로 스크립트 파일을 선택하세요. 매크로에서 제공하는 화면 지시를 따르세요. 매크로가 표시되면 E-cadherin 채널을 선택하세요.

다음으로 이미지로 이동해 조정을 선택한 후 임계값을 선택하면 E-캐더린 채널의 임계값을 수동으로 조정합니다. 표피 부위가 완전히 포착되면 확인 버튼을 누르세요. 그 후 분할 진행 메시지가 뜨면 DAP-E 채널을 선택하세요.

임계값 함수를 사용할 때 핵 분할의 강도 수준을 자동으로 정의할 수 있습니다. StarDist의 경우 Image J에서 플러그인을 열고, 핵 탐지 모델을 StarDist 그래픽 인터페이스에 불러온 후 핵 채널을 클릭하여 분석을 선택하세요. 이제 StarDist에서 타일 설정을 예상 패치 크기인 256 x 256 픽셀에 맞게 조정하세요.

질문이 나오면 '예'를 선택하여 핵 내 마커 강도를 측정합니다. 그 후 각 형광 채널에 대해 분할 및 분석 과정을 반복합니다. 모든 채널이 처리된 후, 매크로에서 지시한 대로 출력 데이터를 쉼표로 구분된 값 파일로 저장합니다.

세포질 영역의 경우, 임계값 함수를 사용해 핵 분할이 수행된 후 이진 확장을 적용하여 관심 있는 핵 영역을 확장합니다. StarDist가 핵 분할에 사용된 경우, 관심 있는 핵 영역에 확대 확장을 적용합니다. 전체 셀 영역 내 마커 강도를 측정하라는 안내 시 '예'를 선택하세요.

그 후 매크로 명령어에 따라 콤마 구분 값 형식으로 저장합니다. 등형 대조 샘플을 사용하여 마커 특이적 강도 임계값을 설정합니다. 적절한 Jupyter 노트북을 다운로드한 후 Google Collab에서 파일을 선택한 뒤 노트북을 열면 됩니다.

파일을 선택하고 코드 셀을 순차적으로 실행하세요. 파일 선택 옵션이 뜨면 버튼을 클릭하고 쉼표 구분된 값 파일을 업로드하세요. 각 항체에 대해 아이소타입 제어 파일을 사용하여 평균 형광 강도를 계산합니다.

컷오프 임계값을 결정하려면 점도 노트북을 열고 아이소타입 제어 데이터를 업로드한 후 코드를 실행하세요. 아이소타입 대조와 특정 항체 데이터의 점(dot) 분포를 바탕으로, 배경 신호와 실제 마커 발현을 구분하기 위한 강도 임계값을 선택합니다. 이 임계값을 사용하여 각 세포를 주어진 마커에 대해 양성 또는 음수로 분류합니다.

마지막으로, Google Collab 노트북에서 닷플롯 코드를 실행하여 마커의 공동표현 패턴을 시각화할 수 있는 도트 플롯을 만드세요. 수작업 분할 영상에서 비멘틴 양성 세포는 강한 세포질 신호를 보였으며, ROI 경계는 세포체 전체를 덮고 있었습니다. SCAnED 반자동 분할은 임계값 및 확장법을 사용하여 유사한 경계를 가진 비멘틴 양성 세포를 포착했습니다.

21개 세포에서 비멘틴 강도의 정량 비교 결과, 수동 분절과 SCAnED 분할 간 유의한 차이가 없음을 보였다. 지스토그램 분석 결과, 건선 진피에서 건강한 피부보다 비멘틴 양성 세포의 빈도가 더 높게 나타났습니다. 피부 세포에 대한 점도 분석에서 건선에서 건강한 피부보다 CD-90 양성 비멘틴 양성 세포가 증가한 것으로 나타났습니다.

표피에서는 건선 샘플에서 건강한 피부에 비해 CD-90 양성 비멘틴 음성 세포, 아마도 각질세포가 증가하는 것으로 나타났습니다. 건선성 및 건강한 표피에서 비멘틴 양성 세포 수는 SCAnED와 QuPath 간 유사하였다. 시각적 분할 검사 결과, SCAnED는 여러 경계 세포를 잘못 할당한 QuPath보다 표피에 더 정확하게 할당되었습니다.