포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

이 프로젝트는 포유류 유전자 발현을 위한 다성분 광유전학 도구인 LACE를 최적화하고 특성화하는 고처리량 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 우선, HEK 293 T 세포가 들어 있는 세포 배양 플라스크를 생물안전 캐비닛 안에 넣으세요. 사용한 배지를 흡인하기 위해 혈청학적 피펫을 사용하세요.

플라스크 한쪽 모서리에 10밀리리터의 DPBS를 피펫팅한 후 부드럽게 돌려 세포를 세척하세요. 그 후 세척액을 흡입한 후 DPBS와 흡입기를 폐기통에 버립니다. 이제 플라스크에 0.05% 트립신-EDTA 1.5밀리리터를 넣어 표면을 덮고 배양합니다.

플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 표면에서 느슨하게 만드세요. 다음으로, 신선한 DMEM 8.5밀리리터를 플라스크에 피펫으로 채웁니다. 용액을 위아래로 흡입하여 응집체가 보이지 않을 때까지 셀을 다시 현탁시킵니다.

그 다음 9밀리리터의 셀 현탁액을 15밀리리터 원뿔관에 옮깁니다. 플라스크에 신선한 DMEM 9밀리리터를 추가하세요. 현탁 부탁물을 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소 이하로 수합할 때까지 배양하세요.

이제 10마이크로리터의 부유 세포와 10마이크로리터의 트립신 염료를 1:1 비율로 섞어 혈액세포계를 이용해 세포 농도를 계산합니다. 고성능 1.5 검은색 96웰 유리 바닥판의 각 웰에 약 35,000개의 세포를 100마이크로리터 단위로 씨앗합니다. 플레이트를 37도 섭씨, 5% 이산화탄소 온도로 설정한 인큐베이터에 24시간 넣으세요.

형질전환을 위해서는 먼저 11마이크로리터의 따뜻한 혈청 무첨가 DMEM을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 1우정과 10% 남량을 할당합니다. CRY2 증강 녹색 형광 단백질과 CIBN 가이드 RNA/알리코트의 다양한 플라스미드 질량 비율을 각 혈청 무배지 알리코트가 포함된 각 튜브에 준비된 용액의 웰당 110나노그램을 준비합니다. 그 후 각 웰마다 혈청 무첨가 DMEM 11마이크로리터를 별도의 튜브에 피펫하여 형질전환 시약 희석을 진행합니다.

희석된 형질전환 시약을 DNA 배양 혼합물에 첨가하고 인큐베이션하여 형질전환 복합체를 형성합니다. 그 후 준비된 형질전환 복합체 20마이크로리터를 HEK 293 T 세포가 포함된 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 96웰 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고, 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소 이하로 24시간 동안 인큐베이터에 넣으세요.

활성화 과정을 시작하려면, 지정된 스크립트 라인을 사용해 원하는 우물을 밝히도록 마이크로컨트롤러 입력 코드를 수정합니다. 표시된 코드 라인을 사용해 발광 다이오드 세기를 9.27밀리와트/제곱센티미터로 설정하세요. 펄스 길이를 1초로 조정한 후 펄스 주파수를 0.067 헤르츠로 설정하는데, 이는 15초마다 해당됩니다.

옵토플레이트의 3D 프린팅 뚜껑에 70% 에탄올을 뿌리세요. 그 후 바이오세이프티 캐비닛에서 건조시키세요. 이제 암실에서 빨간 조명을 켜.

96웰 플레이트를 생물안전 캐비닛에 넣으세요. 플레이트 뚜껑을 말린 3D 프린팅 뚜껑으로 교체하세요. 96웰 플레이트를 LED 배열에 올려 활성화 장치를 조립하세요.

완전히 조립된 LED 배열 장치를 37도 섭씨, 5% 이산화탄소 온도로 설정된 인큐베이터에 24시간 넣으세요. 마이크로컨트롤러, 발광 다이오드, 팬 포트를 전원 공급원에 연결하세요. 유세포분석(flow cytometry)을 수행하려면 사이트 전문가 소프트웨어에서 시스템 시작 프로그램을 실행하세요.

샘플 로더에 2밀리리터의 탈이온수를 주입하세요. 제공된 품질 관리 비즈를 사용해 품질 관리를 진행하세요. 채취할 샘플 우물을 설정하고 지정합니다.

측면 산란과 전방 산란, 측면 산란 높이와 측면 산란 면적, 측면 산란 면적과 FITC-A, 그리고 FITC-A 통계표에 대한 그래프와 표를 만드세요. 이제 V-bottom 960-웰 플레이트를 세포계의 플레이트 로더에 끼워 넣으세요. 트랜스펙트되지 않은 우물을 선택하고 초기화 버튼을 클릭한 뒤 실행을 선택하세요.

측면 산란과 FITC 전압을 조정하여 관심 대상을 SSC-A 대 FSC-A 플롯에 중심에 맞춥니다. 'Run'을 클릭한 후 CMV 강화 녹색 형광 단백질을 잘 트랜스펙션한 것을 선택하세요. SSC-A 대 FITC-A 플롯에 자가형광 세포와 형광 세포를 모두 포함하도록 FITC 전압을 조정합니다.

건강한 세포 집단을 차단할 다각형을 만드세요. SSC-H와 SSC-A 플롯에서 더블렛 구별을 위한 두 번째 다각형 → 게이트. 형질전환되지 않은 세포의 게이트를 기준으로 형광 세포와 비형광 세포를 구분하는 다각형 게이트를 만든다.

200초가 경과되거나 10,000건의 사건이 도달할 때까지 분당 60마이크로리터의 샘플을 자동 기록합니다. 그 다음 평균 FITC 값을 CSV 파일로 내보내고 데이터를 분석합니다. 플로우 사이토미터는 일일 세척 옵션을 선택해 청소하세요.

형광 영상 검사 결과, 질량 비율이 1:9일 때 청색광 활성화가 5:5 비율에 비해 최대 eGFP 발현이 낮아졌으며, 5:5 비율에서는 어두운 상태에서 누출이 증가하는 것으로 나타났습니다. 유세포검사 결과, P1에서 게이트 이벤트의 95% 이상이 모든 조건에서 단일 사건임을 보여주었습니다. 그리고 형질전환되지 않은 세포는 eGFP 양성 개체군이 0.1% 미만이었습니다.

CMV-eGFP 대조군은 약 99%의 eGFP 양성 세포를 보였고, 2pLACE 형질감염 세포는 약 57%를 보였습니다. CMV-eGFP 형질감염 세포는 밝은 조건과 어두운 조건 모두에서 강한 구성성 eGFP 발현을 보였으며, 형질전환되지 않은 세포는 눈에 띄는 형광을 보이지 않았습니다. 또한 2pLACE의 성공적인 형질전환과 CMVeGFP보다 낮은 발현 상태에서 청색광 하에서 eGFP 발현 활성화를 확인했습니다. 빛에 의해 활성화된 2pLACE 샘플에서는 어두운 환경에 비해 eGFP 발현이 3배 증가하는 것이 관찰되었습니다.

2pLACE 형질전환 샘플에서 eGFP 양성 세포의 비율은 약 60%였으며, 3대 7 질량 비율이 가장 높은 평균 형광 강도와 동적 범위를 보였습니다. 이 프로토콜은 샘플의 고처리량 평가와 옵토플레이트를 이용한 기술적 복제를 가능하게 하여 다양한 빛 조건과 펄스 주파수를 프로그래밍할 수 있습니다.