저밀도 지단백질의 존재 하에서 호중구 세포외 트랩을 이용한 혈관 내피 세포의 자극

호중구 세포외 트랩은 심혈관 질환을 포함한 다양한 질병에 관여합니다. 그러나 혈관 세포에 대한 NET 형성과 지단백질의 시너지 효과는 불분명합니다. 이 프로토콜을 활용하여 호중구 세포외 트랩 및 저밀도 지단백질로 처리된 인간 대동맥 내피 세포에서 염증 반응이 어떻게 유도되는지에 대한 기계론적 분석이 현재까지 진행 중입니다.

우리는 고밀도 지단백질이 NET 형성의 억제 인자로 작용한다는 것을 입증했습니다. 이는 산화된 저밀도 지단백질, 산화된 인지질 및 리소인지질에 의해 촉진됩니다. 시작하려면 헤파린 튜브에서 얻은 인간 전혈 45-50밀리리터를 섭씨 4도에서 15분 동안 700G으로 원심분리합니다.

탈수 후 원심분리기 속도를 천천히 줄인 다음 혈장 분획이 포함된 상층을 수집합니다. 혈장 분획을 섭씨 4도에서 15분 동안 700G에서 2회 원심분리하여 동일한 감속 설정을 유지하면서 혈액 세포를 완전히 제거합니다. 그런 다음 혈장 1밀리리터당 1마이크로리터의 250밀리몰 EDTA 용액을 첨가하여 지단백질의 2가 금속 이온 매개 산화를 방지합니다.

2.7밀리리터의 혈장을 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 250마이크로몰 EDTA를 함유한 900마이크로리터의 PBS로 오버레이합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 7분 동안 600, 000G에서 초원심분리합니다.

다음으로, 최상층에서 900마이크로리터를 버려 킬로미크론 분획을 제거합니다. 남은 혈장 위에 EDTA를 함유한 PBS 900마이크로리터를 첨가하고, 섭씨 4도에서 2.5시간 동안 600, 000G에서 초원심분리한다. 매우 낮은 밀도의 지단백질 분획을 제거하기 위해 최상층의 900마이크로리터를 버립니다.

그런 다음 밀리리터당 0.5g의 브롬화칼륨 용액 540마이크로리터를 혈장에 첨가하여 밀도를 1.063으로 조정합니다. 피펫과 초원심분리기를 사용하여 내용물을 섭씨 4도에서 2.5시간 동안 600, 000G에서 부드럽게 혼합합니다. 저밀도 지단백을 함유한 최상층 540마이크로리터를 수집합니다.

수집된 분획을 투석막으로 옮기고 브롬화칼륨을 제거하기 위해 섭씨 4도에서 EDTA를 함유한 PBS 2리터에 대해 투석합니다. 152마이크로리터의 0.01% 폴리라이신 또는 0.1% 젤라틴 용액을 12웰 플레이트의 각 웰에 넣고 실온에서 최소 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 우물에서 용액을 제거하고 200마이크로리터의 멸균수로 한 번 세척한 다음 우물을 실온에서 완전히 건조시킵니다.

준비된 접시는 추가 사용할 때까지 실온에 보관하십시오. 폴리라이신에 대해 시연된 것과 동일한 절차에 따라 젤라틴 코팅 플레이트를 준비합니다. 2마이크로몰 올트랜스 레티노산을 보충한 RPMI-1640 배지에서 10밀리리터당 6개의 HL60 세포의 10승을 2배 배양합니다.

all-trans retinoic acid와 함께 4일 동안 배양한 후 HL60 세포를 수집합니다. 수집된 세포를 섭씨 18도에서 22도에서 4분 동안 220G에서 원심분리합니다. 상청액을 흡인한 다음 동일한 부피의 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포를 세척합니다.

세척된 세포를 섭씨 18도 내지 22도에서 4분 동안 220G에서 다시 원심분리하고 무혈청 RPMI-1640 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포 농도를 밀리리터당 6셀의 2배 10으로 조정한 후, 폴리리신으로 사전 코팅된 12웰 플레이트의 각 웰에 현탁액 0.5밀리리터를 시드합니다. 300나몰 포르볼, 12-미리스테이트 13-아세테이트 또는 PMA를 포함하거나 포함하지 않는 무혈청 RPMI-1640 배지 100마이크로리터를 추가합니다.

세포를 30분 동안 배양합니다. 다음으로 우물에서 배지를 제거합니다. 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포를 한 번 세척하고 밀리리터당 0 또는 20마이크로그램의 저밀도 지단백질을 함유한 무혈청 RPMI-1640으로 교체합니다.

2시간 동안 세포를 계속 배양합니다. 각 웰에서 배양 배지를 튜브로 수집하고 섭씨 18도에서 22도에서 3분 동안 700G에서 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 자극을 위해 인간 대동맥 내피 세포 배양액을 얻고 사용한 배지를 0.5밀리리터의 신선한 배양 배지로 교체하고 세포를 30분 동안 배양합니다.

마지막으로, 호중구 세포외 트랩 및 LDL을 포함하는 호중구 유사 세포에서 수집한 배양 배지 167마이크로리터를 인간 대동맥 내피 세포 접시에 첨가합니다. 호중구 세포외 트랩으로 인간 대동맥 내피 세포를 자극하면 조약돌 모양에서 길쭉한 모양으로 용량 의존적 형태학적 변화가 발생했습니다. 인간 대동맥 내피 세포의 형태학적 변화는 LDL 유도 호중구 세포외 트랩으로 자극했을 때 강화되었으며, 빠르면 6시간 만에 눈에 띄는 신장이 명백하게 나타났습니다.