자연 살해 세포 활성화의 신속한 무표지 분석을 위한 현장 배치 가능한 렌즈 프리 이미징 플랫폼

우리의 목표는 면역 모니터링을 강화하기 위해 무표지, 무렌즈 이미징을 사용하여 NK 세포 활성화를 실시간으로 정량화함으로써 면역 기능을 신속하게 평가하는 것입니다. 우리는 선천성 면역 지수(I3)가 건강한 기증자와 면역 저하 기증자의 NK 세포 활성을 안정적으로 구별하고 사이토카인 및 유세포 분석 마커와 강한 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 기존 NK 세포 분석에는 라벨, 부피가 큰 기기 및 긴 배양 시간이 필요합니다.

당사의 LSIT 플랫폼은 간단한 광전자공학을 사용하여 빠르고 저렴하며 라벨이 필요 없는 프로파일링을 가능하게 함으로써 이러한 격차를 메웁니다. 당사의 무표지 LSIT 플랫폼은 섀도우 파라미터를 사용하여 30초 이내에 단일 세포 수준에서 NK 세포 활성화를 구별하므로 염색 및 비용이 많이 드는 유세포 분석이 필요하지 않습니다. 우리는 LSIT를 확장하여 T 및 B 세포 활성화를 모니터링하고 다양한 면역 세포 상태의 고처리량 분류를 위한 딥 러닝 알고리즘을 통합할 것입니다.

시작하려면 자연 살해 또는 NK 세포 분리용 키트를 냉장고에서 꺼내 섭씨 15도에서 28도 사이의 실온으로 두십시오. 자기 분리기, 멸균 팁이 있는 피펫을 배치하고 인큐베이터 또는 가열 블록을 섭씨 37도로 설정하여 필요한 장비를 준비합니다. 피펫을 사용하여 항체 칵테일이 들어 있는 녹색 캡이 있는 반응 튜브에 전혈 0.5밀리리터를 추가합니다.

튜브를 위아래로 5-6회 피펫팅하여 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 5분 동안 배양합니다. 피펫을 사용하여 녹색 캡 튜브의 전체 내용물을 빨간색 캡 분리 튜브로 옮기고 튜브를 5-6회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

빨간색 캡이 있는 튜브를 마그네틱 분리기에 놓고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 자석을 제자리에 유지하면서 피펫을 사용하여 약 1.5밀리리터의 상청액을 보라색 캡이 있는 분리 튜브 2로 옮깁니다. 튜브를 5-6회 피펫팅하여 내용물을 부드럽게 혼합합니다.

이제 보라색 캡이 있는 튜브를 자기 분리기에 놓고 10분 동안 배양합니다. 자석이 제자리에 있는 동안 피펫을 사용하여 회색 뚜껑이 있는 회수 튜브에 약 1밀리리터의 상청액을 옮기고 튜브를 피펫팅하여 내용물을 조심스럽게 혼합합니다. 다음으로, 분리된 자연 살해 세포 현탁액 100마이크로리터를 비히클 튜브에 추가하고 활성화 자극제 칵테일(ASC) 튜브에 100마이크로리터를 추가합니다.

고르게 분포되도록 와류 혼합기를 사용하여 두 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 섭씨 37도로 설정된 가열 블록 또는 인큐베이터에서 튜브를 1시간 동안 배양합니다. LSIT 플랫폼을 켭니다.

LSIT 캡처 소프트웨어를 실행합니다. ID와 비밀번호를 입력하여 로그인한 다음 보정을 선택하여 보정 모드를 시작합니다. 터치스크린의 열기 버튼을 누르거나 물리적 슬라이딩 도어 버튼을 사용하여 서랍을 엽니다.

서랍이 열리면 보정 슬라이드를 제거하고 보관하십시오. 이제 배경 설정을 클릭하여 광학 강도를 보정합니다. 서랍의 보정 슬라이드를 교체하고 서랍을 닫습니다.

그런 다음 보정 시작을 클릭하여 프로세스를 완료합니다. 파우치에서 분석 슬라이드를 꺼냅니다. 깨끗하고 평평한 표면에 놓기 전에 샘플 데이터로 라벨을 붙입니다.

비히클 샘플 10마이크로리터를 채널 A와 B에 피펫팅한 다음 ASC 자극 샘플 10마이크로리터를 채널 C와 D에 피펫팅합니다. 이제 열기를 눌러 서랍을 꺼냅니다. 보정 슬라이드를 제거하고 보관 상자에 넣습니다. 준비된 분석 슬라이드를 서랍에 삽입하고 닫기를 눌러 고정합니다.

메인 메뉴로 돌아가서 메인 화면에서 NK 세포 활동 및 테스트를 선택합니다. 샘플 ID를 입력하거나 바코드를 스캔하여 샘플 프로필을 로드합니다. 그런 다음 캡처를 눌러 이미지 녹화를 시작합니다.

이미지를 캡처한 후 분석을 클릭하여 처리를 시작합니다. 화면에 표시된 NK 세포 활성 백분율과 세포 수를 검토합니다. 결과를 USB 드라이브에 다운로드하거나 터치스크린 메뉴를 사용하여 인쇄합니다.

LSIT 기본 인터페이스에서 세포 계수 및 테스트를 선택합니다. 피펫을 사용하여 새 샘플 10마이크로리터를 새로운 분석 슬라이드 채널에 로드합니다. 슬라이드를 서랍에 삽입합니다.

터치스크린이나 버튼을 사용하여 서랍을 닫고 시스템에 샘플 ID를 입력합니다. 해당되는 경우 터치스크린에 희석 계수를 입력하고 Counting을 눌러 세포 정량화를 시작합니다. 화면에 마이크로리터당 셀로 표시된 결과를 봅니다.

분석 후 열기 버튼을 누르거나 물리적 스위치를 전환하여 서랍을 엽니다. 장갑을 낀 손을 사용하여 서랍에서 사용한 슬라이드를 꺼냅니다. 마지막으로 보정 슬라이드를 서랍에 다시 넣어 센서를 보호하고 터치스크린 또는 물리적 토글 스위치를 사용하여 서랍을 닫습니다.

통합 소프트웨어가 있는 LSIT 플랫폼은 활성화된 대조군 세포와 자극되지 않은 대조군 세포의 CSP 값을 비교하여 NK 세포 활성화를 정량적으로 평가했습니다. 면역 보고서에 요약된 통계표를 제공했습니다. ASC 자극은 30분 및 2시간 후에 Hema 3 염색 Cytospins에서 볼 수 있듯이 크기 증가 및 세포질 복잡성을 포함하여 NK 세포에 명확한 형태학적 변화를 유도했습니다.

그림자 이미지는 ASC 자극 세포가 비히클 대조군에 비해 눈에 띄게 더 복잡한 회절 패턴을 가졌으며, 추출된 매개변수는 증가된 피크 간 거리, 세포질 세분성 및 결합된 그림자 매개변수를 나타냅니다. 결합된 그림자 매개변수 값을 통해 건강한 기증자와 암 환자 사이를 명확하게 분류할 수 있었으며, 활성화된 NK 세포와 비활성화된 NK 세포의 단일 세포 분포의 중복을 최소화했습니다. 건강한 기증자는 ASC 자극 후 암 환자보다 훨씬 더 높은 선천성 면역 지수 값을 보였습니다.