Name: RPA/CRISPR/Cas12a 시스템과 결합된 알칼리 용해를 통한 트리파노소마티드 기생충 및 노세마 세라네 의 현장 DNA 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 학습하세요 RPA와 CRISPR/Cas12a를 결합한 알칼리 용해 현장 DNA 검출법으로 꿀벌 병원체 Lotmaria passim과 Nosema ceranae를 신속하게 진단하는 방법을 배우세요. 이 기술은 전통적인 QPCR보다 높은 민감도를 제공합니다.

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<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
<li>Murphy, J. T., Breeze, T. D., Willcox, B., Kavanagh, S., Stout, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globalisation+and+pollinators%3A+pollinator+declines+are+an+economic+threat+to+global+food+systems%5BTitle%5D)+AND+%22People+and+Nature%22%5BJournal%5D)">Globalisation and pollinators: pollinator declines are an economic threat to global food systems.</a> People and Nature. 4 (3), 773-785 (2022).</li>
<li>Zattara, E. E., Aizen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+occurrence+records+suggest+a+global+decline+in+bee+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22One+Earth%22%5BJournal%5D)">Worldwide occurrence records suggest a global decline in bee species richness.</a> One Earth. 4 (1), 114-123 (2021).</li>
<li>Carreira de Paula, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promastigote+EPS+secretion+and+haptomonad+biofilm+formation+as+evolutionary+adaptations+of+trypanosomatid+parasites+for+colonizing+honeybee+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Promastigote EPS secretion and haptomonad biofilm formation as evolutionary adaptations of trypanosomatid parasites for colonizing honeybee hosts.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 27(2024).</li>
<li>Requier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+large-scale+study+reveals+important+losses+of+managed+honeybee+and+stingless+bee+colonies+inLatin+America%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">First large-scale study reveals important losses of managed honeybee and stingless bee colonies inLatin America.</a> Sci Rep. 14 (1), 10079(2024).</li>
<li>Babin, A., Schurr, F., Rivière, M. P., Chauzat, M. P., Dubois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+and+quantification+of+three+microsporidia+infecting+bees%2C+Nosema+apis%2C+Nosema+ceranae%2C+and+Nosema+bombi%2C+using+probe-based+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Protistol%22%5BJournal%5D)">Specific detection and quantification of three microsporidia infecting bees, Nosema apis, Nosema ceranae, and Nosema bombi, using probe-based real-time PCR.</a> Eur J Protistol. 86, 125935(2022).</li>
<li>Cameron, T. C., Wiles, D., Beddoe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+loop-mediated+isothermal+amplification+technologies+for+the+detection+of+honeybee+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Current status of loop-mediated isothermal amplification technologies for the detection of honeybee pathogens.</a> Front Vet Sci. 8, 659683(2021).</li>
<li>Schurr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+of+six+honeybee+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative real-time RT-PCR assays for the detection of six honeybee viruses.</a> J Virol Methods. 270, 70-78 (2019).</li>
<li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+real-time+PCR+for+detection+of+Crithidia+mellificae+and+Lotmaria+passim+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Triplex real-time PCR for detection of Crithidia mellificae and Lotmaria passim in honeybees.</a> Parasitol Res. 117 (2), 623-628 (2018).</li>
<li>D'Alvise, P., Seeburger, V., Gihring, K., Kieboom, M., Hasselmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+dynamics+and+co-occurrence+patterns+of+honeybee+pathogens+revealed+by+high-throughput+RT-qPCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Seasonal dynamics and co-occurrence patterns of honeybee pathogens revealed by high-throughput RT-qPCR analysis.</a> Ecol Evol. 9 (18), 10241-10252 (2019).</li>
<li>Shao, G., Zhu, X., Hua, R., Chen, Y., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+copro-RPA-CRISPR%2FCas12a+assay+to+detect+Echinococcus+granulosus+nucleic+acids+isolated+from+canine+feces+using+NaOH-based+DNA+extraction+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of a copro-RPA-CRISPR/Cas12a assay to detect Echinococcus granulosus nucleic acids isolated from canine feces using NaOH-based DNA extraction method.</a> PLoS Negl Trop Dis. 18 (12), e0012753(2024).</li>
<li>Xiao, Y., Fei, D., Li, M., Ma, Y., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+application+of+CRISPR-Cas12a-based+recombinase+polymerase+amplification+and+a+lateral+flow+dipstick+and+fluorescence+for+the+detection+and+distinction+of+deformed+wing+virus+types+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Establishment and application of CRISPR-Cas12a-based recombinase polymerase amplification and a lateral flow dipstick and fluorescence for the detection and distinction of deformed wing virus types A and B.</a> Viruses. 15 (10), 2041(2023).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OPRAD%3A+a+one-pot+RPA%2FPCR+CRISPR%2FCas12+assay+for+on-site+Phytophthora+root+rot+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cas-OPRAD: a one-pot RPA/PCR CRISPR/Cas12 assay for on-site Phytophthora root rot detection.</a> Front Microbiol. 15, 1390422(2024).</li>
<li>Osmundson, T. W., Eyre, C. A., Hayden, K. M., Dhillon, J., Garbelotto, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+an+evaluation+of+NaOH+and+alternative+rapid+DNA+extraction+protocols+for+DNA+barcoding%2C+genotyping%2C+and+disease+diagnostics+from+fungal+and+oomycete+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Back to basics: an evaluation of NaOH and alternative rapid DNA extraction protocols for DNA barcoding, genotyping, and disease diagnostics from fungal and oomycete samples.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 66-74 (2013).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Klintschar, M., Neuhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alkaline+lysis+method+for+the+extraction+of+DNA+from+whole+blood+and+forensic+stains+for+STR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alkaline lysis method for the extraction of DNA from whole blood and forensic stains for STR analysis.</a> J Forensic Sci. 45 (3), 669-673 (2000).</li>
<li>Galanis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+foraging+preferences%2C+microbiota+and+pathogens+revealed+by+direct+shotgun+metagenomics+of+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Bee foraging preferences, microbiota and pathogens revealed by direct shotgun metagenomics of honey.</a> Mol Ecol Resour. 22 (7), 2506-2523 (2022).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+alkali+lysis+method+for+Plasmodium+falciparum+DNA+extraction+from+filter+paper+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A simple alkali lysis method for Plasmodium falciparum DNA extraction from filter paper blood samples.</a> Mol Biochem Parasitol. , 254(2023).</li>
<li>Shwani, A., Zuo, B., Alrubaye, A., Zhao, J., Rhoads, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+inexpensive+alkaline+method+for+bacterial+DNA+extraction+from+environmental+samples+for+PCR+surveillance+and+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple, inexpensive alkaline method for bacterial DNA extraction from environmental samples for PCR surveillance and microbiome analyses.</a> Appl Sci. 14 (1), 141(2024).</li>
<li>Fowler, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cost-effective%2C+morphology-preserving+method+for+DNA+isolation+from+bulk+invertebrate+trap+catches%3A+tephritid+fruit+flies+as+an+exemplar%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a cost-effective, morphology-preserving method for DNA isolation from bulk invertebrate trap catches: tephritid fruit flies as an exemplar.</a> PLoS One. 18 (2), e0281759(2023).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-mediated+hue-recognition+lateral+flow+assay+for+point-of-need+detection+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-mediated hue-recognition lateral flow assay for point-of-need detection of Salmonella.</a> Anal Chem. 96 (1), 220-228 (2024).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+and+rapid+detection+of+pathogenic+Yersinia+enterocolitica+based+on+the+CRISPR%2FCas12a+nucleic+acid+identification+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive and rapid detection of pathogenic Yersinia enterocolitica based on the CRISPR/Cas12a nucleic acid identification platform.</a> Foods. 11 (14), 2160(2022).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+PCR-based%2C+LAMP+and+RPA-CRISPR%2FCas12a+assays+for+the+rapid+detection+of+Diaporthe+aspalathi%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of PCR-based, LAMP and RPA-CRISPR/Cas12a assays for the rapid detection of Diaporthe aspalathi.</a> Int J Mol Sci. 25 (11), 5773(2024).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas12a+combined+with+recombinase+polymerase+amplification+for+rapid+and+sensitive+detection+of+Vibrio+vulnificus+in+one+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification for rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus in one tube.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 55 (2), 322-326 (2023).</li>
<li>Li, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+assay+combining+fluorescence+and+lateral+flow+strips+for+the+rapid+detection+of+enterotoxigenic+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">An RPA-assisted CRISPR/Cas12a assay combining fluorescence and lateral flow strips for the rapid detection of enterotoxigenic Bacillus cereus.</a> J Agric Food Chem. 72 (24), 14000-14010 (2024).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+SARS-CoV-2+detection+platform+based+on+RT-RPA+and+CRISPR%2FCas12a%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a.</a> J Transl Med. 19 (1), 74(2021).</li>
<li>Aman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iSCAN-V2%3A+a+one-pot+RT-RPA-CRISPR%2FCas12b+assay+for+point-of-care+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).</li>
<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+RPA-CRISPR+Cas12a%2FCas13a+rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">One-tube RPA-CRISPR Cas12a/Cas13a rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Anal Chim Acta. 1278, 341757(2023).</li>
<li>Nguyen, L. T., Smith, B. M., Jain, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+trans-cleavage+activity+of+Cas12a+with+engineered+crRNA+enables+amplified+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection.</a> Biochemistry. 59 (17), 1474-1481 (2020).</li>
<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>0.2 mL DNAse 및 RNAse가 없는 Eppendorf 튜브</td><td>액시젠</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNAse 및 RNAse가 없는 Eppendorf 튜브</td><td>액시젠</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 & 뮤; L 저보유 필터링 팁</td><td>랩클리닉</td><td>5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 & 뮤; L 저보유 필터링 팁</td><td>랩클리닉</td><td>5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 & 무; L 저보유 필터링 팁</td><td>랩클리닉</td><td>5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>BH-200 시리즈 스튜어트 드라이 블록 히터</td><td>콜-파머</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>앰비콘</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>엔젠 lba cas12a(cpf1)</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>시그마-알드리치</td><td>시그마-알드리치</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브 유봉</td><td>피셔브랜드</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>밀레니아 젠라인 하이브리디텍트</td><td>밀레니아</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>나오</td><td>시그마-알드리치</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPA 키트 TwistAmp Liquid Basic</td><td>트위스트앰프</td><td>&nbsp; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>스완-모튼</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>싱글 샤넬 파이펫 PIPETMAN P1000L 마이크로피펫 금속 배출</td><td>길슨</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>싱글 샤넬 피펫 PIPETMAN P100L 마이크로피펫 금속 이젝트</td><td>길슨</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>싱글 샤넬 파이펫 PIPETMAN P10L 마이크로피펫 금속 이젝트</td><td>길슨</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>터치 실시간 PCR 검출 시스템</td><td>바이오래드</td><td>CFX96 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>트리스-HCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>티1503</td><td></td></tr><tr><td>트위스트Amp 리퀴드 베이직</td><td>트위스트</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

rpa/crispr/cas12a 시스템과 결합된 알칼리 용해를 통한 트리파노소마티드 기생충 및 노세마 세라네 의 현장 dna 검출

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

여기에서는 RPA 증폭 및 형광 및/또는 측면 유동 접근법에 의한 CRISPR/Cas12a 기반 검출과 결합된 일벌 복부의 알칼리 용해를 사용하는 빠른 현장 방법을 설명했습니다. 전체 워크플로우의 스키마는 그림 3에 나와 있으며, 일벌 복부의 HotSHOT 알칼리 용해 스키마는 그림 4에 나와 있습니다. RPA/CRISPR/Cas12a 분석의 대표적인 결과는 그림 5에 나와 있습니다. L. passim 및 N. ceranae를 검출하기 위해 열순환기를 사용하여 FAM 표지 프로브를 사용하여 상대 형광 단위(RFU)를 정량화했습니다(그림 4A). RPA 반응은 10ng의 DNA를 사용하여 수행되었으며 형광 데이터는 그래프에 표시되었습니다(그림 4B). 분석의 마지막 단계에서 원뿔형 튜브의 샘플을 겔 이미징 시스템을 사용하여 촬영했습니다(그림 4C). 비오틴 표지 프로브를 사용한 검출을 위해 샘플을 열 블록에서 배양했습니다(그림 4A). 검출 용액은 제조업체의 지침에 따라 준비되었으며 측면 흐름 스트립에 적용되었습니다(그림 4B, C). 이 방법을 통해 두 꿀벌 병원체를 모두 성공적으로 검출할 수 있었습니다.
RPA 반응의 효율성을 결정하기 위해 이 방법을 참조된 키트를 사용하여 꿀벌에서 정제된 DNA를 사용하는 표준 qPCR과 비교했습니다(재료 표 참조). 총 32개의 꿀벌 샘플을 두 가지 방법 모두에 대해 L. passim의 β-tubulin 유전자를 표적으로 하는 프라이머로 테스트한 다음 형광 프로브의 CRISPR/Cas12a 트랜스 절단으로 검출했습니다. 특히, 그 결과 12개의 샘플에서 qPCR이 양성으로 밝혀졌으며, RPA/CRISPR/Cas12a는 16개의 샘플에서 L. passim을 검출했습니다(그림 5A). 이는 RPA 반응 성능이 최적 표준 DNA 증폭 방법인 PCR보다 더 민감하다는 것을 나타냅니다.
마찬가지로, 66 ng에서 6 fg 범위의 L. passim DNA의 연속 희석을 사용하여 병원체 모델로서 L. passim DNA에 대한 CRISPR/Cas12a 검출과 결합된 qPCR 및 RPA의 검출 한계(LOD)를 결정했습니다. qPCR은 약 96개의 기생충에 해당하는 6pg만 검출했습니다(그림 5B). 이에 비해 RPA의 LOD는 96개의 기생충에 해당했습니다(그림 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
그림 1: 꿀벌에서 RPA 증폭 및 Cas12 검출 방법과 결합된 HotSHOT 알칼리 용해의 일반적인 워크플로우. 약어: RPA = recombinase polymerase amplification; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = CRISPR 관련 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
그림 2: HotSHOT 버퍼를 사용한 증폭 준비 세포 용해 처리. (A) 메스로 꿀벌의 복부를 잘라 원심분리기 튜브에 넣는다. (B) 유봉으로 400μL의 HotShot으로 침용합니다. (C) 95 ° C의 온도 블록에서 10 분 동안 배양하십시오. (D) 400 μL의 40 mM Tris-HCl로 중화합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
그림 3: Cas12a 효소 및 FAM 및 Biotin 표지 리포터 프로브 용액 준비를 위한 일반적인 워크플로우. 약어: DEPC-물 = 디에틸 피로카보네이트 처리된 물; crRNA= RNA 크리스퍼; Cas12 = CRISPR 관련 단백질의 유형. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
그림 4: FAM 및 비오틴 프로브를 사용한 CRISPR/Cas12a 방법에 의한 Lotmaria passim 및 Nosema ceranae 검출. FAM 검출을 위해 (A) 샘플은 열순환기에서 배양되고 있습니다. (B) L. passim 및 N.ceranae의 상대 형광 단위(RFU); (C) 사진 문서화 시스템에서 동일한 샘플의 시각화. 비오틴 테스트에서, (a) 열 블록에서 배양하는 샘플; (b) 샘플이 키트로부터 면역스트립에 첨가되었습니다(재료 표 참조). (c) 배양 후의 결과. 약어: LP= Lotmaria passim; NC = Nosema ceranae; NTC = 템플릿 컨트롤 없음; RFU: 상대 형광 단위 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
그림 5: qPCR과 RPA의 비교 및 Lotmaria passim의 검출 한계. (A) 기존 qPCR 및 RPA를 사용한 꿀벌 샘플에서 L. passim 검출. (B) SsoFast EvaGreen을 사용한 L. passim 의 qPCR 검출 한계. (C) FAM 표지 프로브와 함께 CRISPR/Cas12a를 사용한 L. passim 의 검출 한계; (D) 겔 이미징 시스템(맨 위 줄)에서 동일한 CRISPR/Cas12a 검출( C에서)의 시각화 및 비오틴 표지 프로브(맨 아래 줄)와 함께 CRISPR/Cas12a를 사용한 해당 측면 유동 결과. 약어: RPA = recombinase polymerase amplification; qPCR= 정량적 중합효소 연쇄 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>최종 집중</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>50 마이크로L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 반응 버퍼</td>
			<td>1배</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>25 마이크로L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP(10mM)</td>
			<td>1.8 밀리미터미터</td>
			<td>1.8 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x 기본 E-믹스</td>
			<td>1배</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포워드 프라이머(10μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>2.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리버스 프라이머(10μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>2.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x 코어 반응 믹스</td>
			<td>1배</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC 물</td>
			<td>--</td>
			<td>0.7 μL</td>
			<td>3.7 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 최종 부피가 10 μL 및 50 μL이고 해당 작업 농도가 있는 RPA용 마스터믹스 성분:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>최종 집중</td>
			<td>10 μL 반응</td>
			<td>50 μL 반응</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM 마그네슘</td>
			<td>1.8 밀리미터미터</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>디에이지</td>
			<td>10-0.1 ng</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: RPA 반응에서 샘플당 첨가되는 시약의 양
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>[재고]</td>
			<td>[결승전]</td>
			<td>1배(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a 효소</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA (세포)</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM 프로브</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 버퍼 10x</td>
			<td>10배</td>
			<td>1배</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 앰플리콘</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>합계</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3: CRISPR/Cas 12a 방법에 의한 FAM 검출을 혼합하기 위한 시약의 농도. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>[재고]</td>
			<td>[결승전]</td>
			<td>1배(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a 효소</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA (세포)</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>비오틴 프로브</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 버퍼 10x</td>
			<td>10배</td>
			<td>1배</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 앰플리콘</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>합계</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 4: CRISPR/Cas 12a 방법에 의한 혼합 비오틴 검출을 만들기 위한 시약의 농도.

RPA/CRISPR/Cas12a 시스템과 결합된 알칼리 용해를 통한 트리파노소마티드 기생충 및 노세마 세라네 의 현장 DNA 검출

Early on-site detection of microscopic pathogens is essential for the effective management and health of honeybee colonies. Currently, the gold standard ...

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연구

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