세 가지 방법론의 비교 분석을 사용하여 암세포 증식에 대한 SASP 요인의 영향 평가

노쇠한 암세포는 이웃 세포에 영향을 미치는 이러한 인자를 분비합니다. 우리는 SASP 구동 파라크린 및 Juxtaccrine 효과를 HeLa 세포 증식에 미치는 영향을 연구하기 위해 세 가지 in vitro 모델을 제시하며, 실시간 임피던스 모니터링과 생세포 영상을 통해 동적·동역학적·형태학적 분석을 통해 전통적인 종말 분석을 넘어 노화 및 미세환경 파라크린 효과를 밝혀냈다. 우선, 세포 시딩하기 전에 실시간 셀 분석 시스템을 켜세요.

RTCA 소프트웨어 버전 2.0을 실행하세요. X 노트 버튼을 클릭하고 실험 내용을 입력하세요. 일정 버튼을 클릭하고 배경 기록과 72시간 동안 15분마다 세포 증식을 모니터링하는 두 단계를 추가하세요.

첫 번째 단계를 선택하고 재생을 클릭하세요. e-플레이트 뷰의 각 웰에 50마이크로리터의 완전한 매질을 수동으로 추가하세요. 다음으로, 노화와 비노화 HeLa 세포 모두를 멸균 예열된 PBS 5밀리리터로 세척합니다.

흡인 후 미리 가열된 0.05% 트립신 1밀리리터를 추가하고 배양합니다. 트립신을 항생제 보충제 5밀리리터로 중화시킵니다. 그 후 셀을 실온에서 500G로 10분간 원심분리합니다.

상정액을 버린 후, 세포 펠릿을 항생제 보충제가 포함된 완전 DMEM 5밀리리터에 다시 부탁합니다. 이제 항생제 보충 완전 DMEM 100마이크로리터 내에 각 e-플레이트 뷰의 각 웰에 비노화 HeLa 세포를 시딩합니다. 전자 플레이트 뷰를 실시간 셀 분석 시스템의 요람에 배치하여 셀이 인큐베이터 내 플레이트 표면에 부착될 수 있도록 합니다.

두 번째 단계를 선택하고 재생을 클릭하여 임피던스 측정을 시작하세요. e-플레이트 삽입 웰 내 종자 세포에는 항생제 보충 완전 DMEM 60마이크로리터가 세 가지 실험 환경에서 사용되었습니다. 부착 시 e-플레이트 삽입물을 5% 이산화탄소가 포함된 인큐베이터에서 6시간 동안 37도 섭씨로 유지하세요.

세포 시딩이 6시간 후 일시정지(Pause)를 클릭한 후, e-플레이트 뷰의 각 웰에서 배양지를 부드럽게 흡입하여 혈청과 비부착 세포를 제거합니다. 37도 섭씨에서 미리 예열된 PBS로 두 번 세척합니다. e-플레이트 뷰의 각 웰에 140마이크로리터의 혈청 무첨가 DMEM을 추가하세요.

매체를 제거하세요. 전자 플레이트 인서트를 PBS로 세척한 후, 혈청이 없는 DMEM 60마이크로리터를 추가합니다. 이제 e-플레이트 인서트를 e-플레이트 뷰에 위치시키세요.

인서트가 우물에 완전히 씨앗이 심어질 때까지 부드럽게 눌러주세요. 결합판을 실시간 셀 분석 시스템에 삽입하세요. 재생을 클릭하면 소프트웨어를 사용해 15분 간격으로 셀 지수 값을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.

e-플레이트 뷰와 e-플레이트 인서트가 결합되어 실시간 셀 분석 시스템에 삽입되는 시점에서 셀 지수 값을 정규화합니다. 다음, 데이터 분석 버튼을 눌러 실시간 셀 분석 시스템에서 얻은 최대 셀 지수와 기울기 데이터를 사용하여 증식률과 양을 계산합니다. 그 후 적절한 통계 프로그램을 사용해 데이터를 분석하세요.

노화 및 비노화 HeLa 세포가 포함된 6웰 플레이트 모두에서 배양지를 흡입합니다. 잔여 혈청과 세포 이물질을 제거하기 위해 37도 섭씨에서 미리 예열된 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 각 웰에 혈청 무첨가 항생제 보조 DMEM 배지 2밀리리터를 추가한 후, 세포를 37도 섭씨에 5% 이산화탄소가 포함된 가습 인큐베이터에서 48시간 배양합니다.

각 웰에서 조절된 매체를 층상 안전 캐비닛의 멸균 튜브에 수집하세요. 수집된 조절된 배지를 1000g에서 4도에서 10분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거하고, 이후 10,000g에서 4도에서 10분간 원심분리하여 정화된 상청액을 얻습니다. 그 후 2밀리리터 초원심 필터 유닛을 사용해 4도 섭씨에서 3000g에서 60분간 원심분리하여 400마이크로리터로 농축합니다.

얻은 농축액을 신선한 무혈청 배지로 희석하여 층상 안전 객실 내 멸균 튜브 내에서 1배, 2배, 3배 농축 조절 매체를 준비합니다. 세포가 부착되면, e-플레이트 뷰의 각 웰에서 배양지를 부드럽게 흡인하여 혈청과 비부착 세포를 제거하고 PBS로 세척합니다. 다음으로, 각 그룹에 37도 섭씨에서 미리 예열된 200마이크로리터의 수집된 조절 배지를 피펫으로 옮깁니다.

e-플레이트 뷰를 실시간 셀 분석 시스템에 삽입하고 재생을 클릭하면 48시간 동안 15분 간격으로 셀 지수 값을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 세 가지 실험 장치 아래 마이크로 슬라이드에 씨앗 세포를 옮기고, 5% 이산화탄소가 포함된 가습 대기에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 부착 8시간 후, 37도에서 예열된 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

각 웰에 세럼 프리 Dulbecco's Modified Eagle's Medium 200마이크로리터를 추가하세요. 온도 조절기 2002-2를 켜고 37도로 설정하세요. CO2-Controller 2000을 켜고 이산화탄소 5%로 설정하세요.

형광광원을 켜. 슬라이드를 스테이지 상단 인큐베이션 챔버에 올려놓으세요. 컴퓨터에서 소프트웨어를 실행하세요.

20배 목표를 선택하세요. 위상 대비 채널과 형광 FITC 채널을 추가하세요. 스테이지 컨트롤러를 사용해 각 위치별 위치를 표시하세요.

시간 간격을 30분, 획득 시간을 48시간으로 설정한 후 획득을 시작하세요. 두 시점 모두에서 녹색 형광 단백질 양성 세포를 세고 분석을 위한 증가율을 계산합니다. 독소루비신 처리는 헬라 세포에서 세포 노화를 유의미하게 유도했습니다.

SA-베타-갈-양성 세포의 정량 분석 결과, 독소루비신 처리 그룹이 대조군에 비해 유의하게 높은 비율을 보였다. 첫 번째 접근법에서, 노화 HeLa 세포와 노화 HeLa 세포가 공배양된 세포는 비노화 HeLa 세포와 공동 배양된 세포에 비해 증식률과 능력이 유의미하게 증가했습니다. 노화 HeLa 세포에서 추출한 2배 및 3배 농도의 조건 배지는 비노화 세포의 조절 배지에 비해 비노화 HeLa 세포의 증식률과 용량을 유의미하게 증가시켰습니다.

세 번째 접근법에서는 48시간 공배양 후, 고령 HeLa 세포와 공동 배양했을 때 비노화 공동 배양 또는 GFP 단독 대조군보다 증식이 유의하게 증가했습니다.