2층 미세유체 장치를 이용한 조직 항상성의 전기기계적 제어 공개

우리는 제어된 전기장을 적용하여 조직이 전기적 신호에 어떻게 반응하는지 연구하며, 전류나 장이 세포 접착, 증식 및 압출을 조절하여 조직 항상성에 영향을 미치는 방법에 중점을 둡니다. 우리는 생리학적으로 관련된 전류의 방향이 조직 상태를 결정한다는 것을 발견했습니다. 정점에서 기저 필드는 증식성 표현형을 유도하는 반면, 기저에서 정점 필드는 세포 압출을 촉진하여 전체 세포 밀도의 조절을 허용합니다.

정량적 생체전기 연구는 오랫동안 중력을 통한 이동에 초점을 맞추어 왔지만 조직 항상성은 여전히 접근할 수 없습니다. 이제 우리 시스템은 생리학적 상자가 조직 조직 및 유지를 어떻게 조절하는지 직접 조사할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 미세유체학, 조직의 전기 자극, 구조 및 힘 현미경, 라이브 이미징을 통합하여 조직 항상성의 전기 역학적 제어를 연구합니다.

우리의 작업은 핵심 전기 기계 결합 규칙을 밝혔습니다. 새로운 도구를 사용하여 이제 우리는 기본 생체 전기 패턴이 어떻게 나타나고 조직을 조절하는지, 그리고 이러한 전기 기계 단서를 조정하여 복잡한 조직 거동을 제어할 수 있는지 탐구할 수 있습니다. 시작하려면 깨끗한 층 1 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 몰드를 깨끗한 플라스틱 접시 뚜껑 위에 위로 향하게 놓고 500마이크로리터의 액체 자외선 경화 접착제를 몰드에 천천히 추가합니다.

주걱을 사용하여 돌출된 모든 구조물을 조심스럽게 적시고 적윤 과정에서 형성된 기포를 제거합니다. 커버 슬립을 PDMS 몰드에 부드럽게 누르고 실험실 와이퍼를 사용하여 과도한 자외선 경화 접착제를 제거하여 커버 슬립의 윗면이 깨끗하고 평평하게 유지되도록 합니다. 파장이 363에서 370나노미터 사이인 균일하게 조명된 자외선 아래에서 구조를 부분적으로 경화시킵니다.

75% 에탄올을 사용하여 자국을 닦아냅니다. 그런 다음 구조물을 평평한 표면에 단단히 고정하고 경화된 층에서 PDMS 몰드를 천천히 벗겨냅니다. 그런 다음 2.5mm보다 두꺼운 평평한 PDMS 슬래브에 깨끗한 레이어 2 PDMS 금형이 아래로 향하도록 놓습니다.

핀셋을 사용하여 위에서 금형 기능을 부드럽게 두드립니다. 어두워짐 또는 광학 대비에 대한 기능 아래의 인터페이스를 관찰하여 적절한 접촉을 확인합니다. 이제 모세관 작용에 의해 PDMS 금형과 슬래브 사이의 공간을 액체 자외선 경화 접착제로 채웁니다.

앞서 설명한 것처럼 자외선 아래에서 10초 동안 구조를 부분적으로 경화시킵니다. 부드러운 패딩 핀셋을 사용하여 PDMS 슬래브에서 복합 자외선 경화 접착층과 PDMS 몰드를 부드럽게 벗겨냅니다. 필요한 경우 날카로운 가위로 경화된 접착제 층의 과도한 가장자리를 다듬습니다.

그런 다음 직사각형 유리 커버 슬립에 부착된 레이어 1을 평평한 표면에 놓습니다. PDMS 몰드에 부착된 레이어 2를 레이어 1과 정렬하고 피처 아래에 그림자가 나타날 때까지 두 레이어를 함께 단단히 누릅니다. 자외선 아래에서 정렬된 구조를 10초 동안 경화하여 1층과 2층을 2층 미세유체 칩으로 결합한 다음 접착된 칩에서 PDMS 금형을 부드럽게 벗겨냅니다.

즉시 10마이크로리터의 폴리아크릴아미드 겔 전구체 용액을 2층의 슬릿 바로 위의 조직 영역 중앙에 피펫팅합니다. 직경 10mm의 둥근 유리 커버 슬립을 물방울에 부드럽게 눌러 평평한 젤을 만듭니다. 겔 용액이 슬릿을 통해 레이어 1로 흐르는 것을 관찰하고 배리어 기둥 행에서 멈춥니다.

조립된 미세유체 칩을 자외선에서 5분 동안 즉시 경화시킵니다. 그런 다음 폴리아크릴아미드 겔이 완전히 응고될 수 있도록 약 1시간 동안 칩을 그대로 둡니다. 다음으로, 미세유체 칩을 pH 7.4의 0.1몰 HEPES 완충액에서 최소 1시간 동안 배양하여 겔에 수화를 공급하고 겔과 커버 슬립 사이의 접착력을 줄입니다.

그런 다음 날카로운 핀셋을 사용하여 젤 표면에서 커버 슬립을 부드럽게 제거합니다. 의료용 폴리카보네이트 카트리지를 바닥이 위로 향하도록 평평한 표면에 놓고 건조된 칩이 카트리지에 앞면이 아래로 향하도록 정렬합니다. 칩과 카트리지 사이의 틈새에 UV 경화 접착제를 피펫팅하여 모세관 효과를 통해 채우고 UV 광선에서 경화시킵니다.

제조된 미세유체 장치를 생물 안전 캐비닛 내부에서 200-280나노미터의 자외선 아래에 놓아 멸균합니다. 얼음 위의 1X DPBS에 밀리리터 콜라겐 1 작업 용액당 50마이크로그램의 필요한 부피를 준비합니다. 얼음 위에서, 섭씨 4도에 보관된 pH 7.4의 차가운 0.1몰 HEPES 완충액 80마이크로리터에 미리 무수 디메틸 설폭사이드에 용해된 2마이크로리터의 Sulfo-SANPAH 원액을 희석하여 Sulfo-SANPAH 작업 용액을 준비합니다.

폴리아크릴아미드 젤의 가장자리를 실험실 물티슈로 두드려 장치 내부에서 건조시킵니다. 80마이크로리터의 Sulfo-SANPAH 작업 용액을 겔 표면에 피펫팅하여 완전히 잠긴 다음 칩을 자외선 아래 5분 동안 놓아 Sulfo-SANPAH를 활성화합니다. pH 7.4에서 차가운 0.1몰 HEPES 완충액으로 겔을 세 번 헹구십시오.

겔 위에 80마이크로리터의 SS 작업 용액을 피펫팅하고 자외선으로 5분 동안 조사하여 Sulfo-SANPAH 처리를 반복합니다. 이번에는 차가운 1X DPBS로 젤을 세 번 헹굽니다. 마지막으로 콜라겐 원 용액 100마이크로리터를 폴리아크릴아미드 젤에 피펫팅하여 완전히 덮고 1시간 동안 그대로 둡니다.

부착되지 않은 콜라겐을 1X DPBS로 세 번 헹구고 추가 사용할 때까지 젤을 1X DPBS에 담근 상태로 유지합니다. 나사를 사용하여 장치를 인서트에 부착합니다. 그런 다음 최대 4개의 장치 인서트 어셈블리를 현미경 스테이지에 장착하도록 설계된 홀더에 고정합니다.

장치의 각 메인 웰에 2밀리리터의 배양 배지를 추가하고 폐기물 제거 채널을 통해 1X DPBS를 세척하고 교체합니다. 그런 다음 백금 전극을 45밀리리터의 배지가 들어 있는 튜브에 삽입하여 배지에 완전히 잠기도록 합니다. 주사기로 Tygon 튜브를 통해 배양 배지를 당겨 단단히 고정합니다.

매체로 채워진 튜브의 한쪽 끝을 전극 챔버에 연결하고 다른 쪽 끝을 장치에 연결합니다. 이제 트립신화 또는 세포 현탁액 준비 권장 사항에 따라 세포 현탁액을 준비하고 10만 개의 세포를 메인 웰에 시드합니다. 측면에 전극 챔버가 있는 현미경에 설정을 장착하고 소스 미터를 전극 챔버에 연결합니다.

동일한 채널 저항을 가진 세 개의 장치를 사용합니다. 하나를 통제 그룹으로 할당합니다. 두 번째 장치에 정점에서 기저 전류를 적용하고 세 번째 장치에 기저에서 정점 전류를 적용합니다.

전류 클램프 모드에서 전기 신호를 소싱하고 총 20마이크로암페어의 전류를 공급합니다. 계시 형광 현미경으로 전체 조직 이미징을 위해 20X 대물 렌즈를 선택하십시오. 마지막으로 적색 형광 및 명시야 채널에 대해 채널 561을 선택합니다.

장시간 이미징 중에 1시간 간격을 선택합니다. 전기 자극은 세포에 수직으로 적용되어 경상피 전위를 파괴하여 다양한 전류 방향에서 조직 거동에서의 역할을 연구했습니다. 위상차 이미징에서 정점에서 기저 또는 ATB 전류는 적용 후 10분 이내에 세포 접합부를 밝게 한 반면, 대조군 및 기저에서 정점으로, BTA 조건은 낮은 대비와 평평한 정점 표면을 보였습니다.

ATB 전류는 정점 세포 표면에서 바깥쪽으로 볼록한 부분을 생성했습니다. 겔 변형은 전류의 방향에 크게 의존했습니다. ATB 전류는 겔을 위쪽으로 끌어당기는 반면 BTA 전류는 겔을 아래쪽으로 압축했습니다.

접합 E-cadherin 강도는 BTA 전류에서 증가했지만 대조군에 비해 ATB 전류에서 크게 감소했습니다. 접합 액틴 강도는 ATB 전류에서 감소했지만 대조군에 비해 BTA 전류에서 크게 증가하지 않았습니다. ATB 전류는 단층을 가로질러 다세포 생세포 돌출을 촉발한 반면, BTA 전류는 대조군과 유사한 단층 구조를 보존했습니다.

세포 분포의 공간적 이질성은 ATB 전류에서 유의하게 높았지만 BTA 및 제어 조건에서는 낮고 균일하게 유지되었습니다. 세포 증식률은 ATB 자극 하에서 증가했으며 시간이 지남에 따라 분열률이 높아졌습니다. 대조적으로, BTA 전류는 더 많은 세포 사멸 사건을 유도했습니다.