Alcian Blue로 염색한 Zebrafish 두개안면 조직의 해부

우리는 고정된 샘플과 라이트 시트 현미경을 사용하여 높은 시공간 해상도로 배아의 타임랩스 이미징을 사용하여 얼룩말 물고기 입천장이 시간이 지남에 따라 성장하는 메커니즘을 탐구하고 있습니다. 우리의 프로토콜은 간단하고 따르기 쉽습니다. 5일 된 제브라피쉬 유충의 두개안면 연골을 해부하고 분리하기 위한 자세한 단계를 제시합니다.

이 프로토콜은 조직 및 세포 규모에서 입천장 모양의 신중한 특성화를 가능하게 하여 궁극적으로 구개 형태 형성에 대한 논평 항원의 효과를 평가할 수 있게 해주었습니다. 시작하려면 마취된 얼룩말 유충 20-25마리를 확보하고 유충이 움직임을 멈추면 마취제를 제거합니다. 튜브에 1.5밀리리터의 4% 파라포름 알데히드를 넣고 실온에서 분당 60회전으로 설정된 로커에 샘플을 2시간 동안 놓습니다.

피펫을 사용하여 튜브에서 가능한 한 많은 고정액을 제거합니다. 그런 다음 샘플에 1.5 밀리리터의 50 % 에탄올을 첨가하고 분당 60 회전으로 설정된 실온에서 10 분 동안 로커에 올려 놓습니다. 이제 피펫을 사용하여 튜브에서 에탄올을 흡인하고 1.5밀리리터의 알시안 블루 염색 용액을 샘플에 첨가합니다.

유충을 염색액에서 실온에서 18-20시간 동안 배양하면서 분당 60회전으로 흔듭니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 얼룩 용액을 제거하고 실온의 로커에서 1.5ml의 증류수로 1-2분 동안 유충을 씻습니다. 그런 다음 표백제 용액 1밀리리터를 샘플에 넣고 튜브를 덮지 않고 실온에서 20분 동안 배양합니다.

피펫을 사용하여 샘플에서 표백제 용액을 제거하고 조직 투명 용액 1과 2로 샘플을 처리합니다. 용액 2를 제거한 후 샘플에 1.5-2밀리리터의 저장 용액을 추가합니다. 글리세롤 함량으로 인해 염색된 샘플이 10분 이내에 점차 바닥으로 가라앉는 것을 관찰하십시오.

염색된 유충을 아가로스 코팅된 페트리 접시의 측면에 놓습니다. 집게를 사용하여 유충 몸에서 노른자를 부드럽게 긁어냅니다. 노른자를 제거한 후 해부 중 간섭을 피하기 위해 유충을 신선한 페트리 접시로 옮기고 한 쌍의 집게를 사용하여 유충을 머리 뒤쪽 근처에 고정합니다.

다른 쌍으로 주변 두개골 안면 구조를 손상시키지 않고 조심스럽게 눈을 제거합니다. 유충을 잡고 있는 동안 한 쌍의 집게로 신경 두개골 등쪽 조직 중앙을 절개합니다. 그런 다음 뇌와 관련 조직을 꼬집어 떼어냅니다.

다음으로, 유충의 머리를 몸의 나머지 부분과 분리합니다. 결과 머리 영역에는 신경 두개골과 내장 두개골이 여전히 앞쪽과 뒤쪽 끝에 부착되어 있어야 합니다. 신경 두개골과 내장 두개골 사이의 두 연결 지점을 집게로 조심스럽게 절단하여 완전히 분리합니다.

마지막으로 깨끗한 유리 슬라이드에 100% 글리세롤 한두 방울을 떨어뜨리고 해부된 신경 두개골 또는 내장 두개골을 슬라이드로 옮깁니다. 집게를 사용하여 기포가 갇히지 않도록 조직 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓고 이미징하기 전에 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다. 해부된 신경 두개골은 사골판, 섬유주, 심낭 연골 등 명확하게 표시된 여러 구조를 나타내어 상세한 구조 분석이 가능했습니다.

내장 두개골에는 메켈 연골과 구개 사각형 및 기저지 연골과 같은 추가 요소가 포함되었습니다. 수정 후 5일째의 알시안 블루 염색은 사골판을 명확하게 시각화할 수 있게 했습니다. 사골판의 폭과 길이는 영상분석을 통해 일관되게 측정할 수 있었고, 길이는 폭보다 유의하게 컸으며, 15개 샘플의 데이터를 정량화하였다.

사골판 영역은 이미지 데이터에서 추출하고 명확한 경계 표시로 정량화를 통해 확인되었습니다. 내측 영역에 직육면체 세포가 있고 측면 부분에 컬럼 세포가 있는 사골판에서 뚜렷한 세포 배열이 관찰되었습니다. Dappy 염색은 사골판 내의 개별 세포 핵을 시각화할 수 있게 했습니다.