다점 티오프플라빈 T 형광을 이용한 돌연변이 P53 V157F 유방암 세포에서 집단 발생 촉진 행동 검출

본 연구는 유방암 세포 내 돌연변이 p53 V157F의 응집 경향을 조사하고, 다점 플레이트 판독을 통해 검출을 평가합니다. 현재 실험적 과제로는 p53 응집의 정확한 검출, 아밀로이드 유사 구조의 정량화, 세포 기반 분석 표면 전반에 걸쳐 일관된 측정 확보가 포함됩니다. 우선, 마이크로 원심분리기 튜브에 10마이크로리터의 트리판 블루를 투여하세요.

같은 튜브에 DPBS에 재현탁된 세포 10마이크로리터를 넣고 내용물을 완전히 혼합하여 균질성을 보장합니다. 준비된 혼합물 10마이크로리터를 카운터 슬라이드에 적재하여 자동 셀 카운터를 사용해 살아있는 세포 수를 세어보세요. 생존 가능 개체 수를 기준으로, 웰당 30,000개의 생존 가능한 세포를 96웰 배양판에 시드합니다.

한 개의 우물을 비염색 통제 구역으로 지정하고, 나머지 세 개의 우물은 염색 구역으로 지정합니다. 저울을 사용해 티오플라빈 T 또는 THT 분말 0.02그램을 계량하세요. 가루를 5밀리리터의 탈이온수에 넣고 완전히 녹을 때까지 충분히 섞으세요.

그 다음 염색 성분을 DPBS 1밀리리터에 추가하세요. THT와 Hoechst 정액을 튜브에 넣고 부드럽게 섞어 균질성을 보장합니다. 이제 96 웰 배양판의 각 웰에서 배양지를 제거하세요.

각 염색 우물에 준비된 THT 및 Hoechst 염색 완충액 100마이크로리터를 추가한 후, 염색되지 않은 제어 우물에 100마이크로리터의 DPBS를 추가합니다. 배양 배지를 어두운 곳, 실온에 30분간 두세요. 각 웰에서 착색액을 조심스럽게 흡입하거나 폐기하되, 세포 단층을 손상시키지 마세요.

그 다음 각 우물에 100마이크로리터의 DPBS를 추가하고 30초간 방치하세요. 그 다음 DPB를 버리세요. 세척 단계를 반복한 후, 각 웰에 신선한 DPBS 100마이크로리터를 추가하세요.

형광 신호를 읽기 전에 96 웰 배양 플레이트의 캡을 제거하세요. 96 웰 배양 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 넣으세요. 450나노미터 여기와 490나노미터 미션을 포함한 THT 형광을 측정하고, 360나노미터와 460나노미터 미션에서 여기된 Hoechst 33342 형광을 측정합니다.

원하는 읽기 영역을 선택한 후, 읽기 매개변수를 설정하세요. 여기에는 상위 리디렉션을 읽기 전 5초간 흔들기, 140밀리초 적분 시간을 포함합니다. 형광 데이터를 획득한 후 단백질 응집 값을 얻기 위한 계산을 수행합니다. 마지막으로 MCF7 세포의 비율을 1로 설정하여 THT 형광 강도를 정규화하여 기준선 대조군으로 삼습니다. 측정은 MCF7과 Hs578T 세포에서 염색된 웰과 비염색 웰을 가로지르는 단일 점법과 4점 방법을 모두 사용하여 수행되었습니다.

Hs578T 유방암 세포는 단일 점 측정법을 사용한 MCF7 세포에 비해 티오프플라빈 T 형광 강도가 3.2배 증가하였습니다. 4점 평균법을 사용했을 때, Hs578T 세포는 MCF7 세포에 비해 티오플라빈 T 형광이 3.86배 증가했습니다. Hs578T 세포에서 티오플라빈 T 형광은 MCF7 세포에 비해 네 가지 측정 지점 모두에서 일관되게 높게 나타났습니다.

이 프로토콜은 티오프플라빈 T 염색과 신뢰할 수 있는 다점 형광판 판독 방법을 결합하여 세포 내에서 정확한 단백질 응집 검출을 가능하게 합니다.