곤충병원성 선충 Steinernema hermaphroditum 의 CRISPR-Cas9 기반 돌연변이 유발과 돌연변이 계통의 유지

우리는 농업에 적용되는 선충 박테리아 공생의 유전학을 연구하고 있습니다. 제노르합두스 박테리아의 유전적 도구는 매우 잘 발달되어 있으나, EPN 유전학은 여전히 제한적이며 주로 RNAi와 EMS 스크리닝에 의존하고 있습니다. 우선, Xenorhabdus griffiniae와 Comamonas aquaticus를 씨앗으로 한 선충 한천 플레이트를 구하세요.

Steinernema hermaphroditum 선충을 Xenorhabdus griffiniae가 포함된 준비된 NGM 판에 채취하세요. 최적의 성장을 위해 25도에서 28도에서 부화하세요. 미세 주입 전날 밤, J3 단계 양성기를 Xenorhabdus griffiniae가 씨앗된 신선한 NGM 한천 플레이트에 채취합니다.

마이크로 주사 당일에는 젊은 성인 양성체 자웅동체를 선택해 주사를 맞으세요. BlastP를 사용하여 Steinernema hermaphroditum 참조 게놈에서 표적 유전자 서열을 추출합니다. 초기 코딩 엑손, 가능하면 첫 번째 엑손을 선택하고, 기본 설정으로 CRISPRscan에 서열을 입력하여 후보 CRISPR RNA를 생성합니다.

상위 후보 CRISPR RNA를 Steinernema 자웅동체 유전체와 비교하여 비표적 일치가 없도록 합니다. 선택된 CRISPR RNA와 범용 트랜스활성화 CRISPR RNA는 각각 100미세몰 크기의 영하 80도 듀플렉스 버퍼에 저장합니다. 전자레인지를 이용해 2%아가로스를 물에 녹여 녹여보세요.

녹인 아가로스 50마이크로리터를 커버 유리에 옮깁니다. 즉시 두 번째 뚜껑 유리잔으로 덮으세요. 20분 건조 후 상단 덮개 유리를 제거한 후 아가로스 패드 앞면에 라벨을 붙입니다.

아가로스 패드는 몇 달에서 몇 년간 장기간 실온에 보관하세요. 주입 준비를 위해 석영 모세관을 레이저 필라멘트 풀러에 올려 피펫 보관함에 보관하세요. 선택된 crRNA와 범용 트랜스활성화 CRISPR RNA를 1:1 비율로 혼합하여 신선한 가이드 RNA 이중분해를 준비합니다.

튜브를 94도 섭씨에서 2분간 배양한 후 실온으로 식혀 더플렉스 어닐링을 합니다. Cas9, 염화칼륨, gRNA 이중체를 결합하여 주사 혼합물을 조립하고 배양하세요. PCR 튜브를 세 번 튕겨 섞은 후, 미니 원심분리기에서 10초에서 15초 정도 잠시 돌립니다.

최종 믹싱 후에는 최대 1분간 돌려 내용물을 수집하세요. 다음으로, 마이크로로더 팁을 사용해 1에서 2마이크로리터의 주사 혼합물을 바늘에 주입하세요. 바늘을 홀더에 장착하고, 헤일로카본 오일 아래 양면 테이프를 끌고 가서 팁을 부수세요.

그리고 마이크로인젝터의 클린 기능을 이용해 구멍 크기를 테스트하세요. 2% 아가로스 패드 위에 작은 할로카본 오일 방울을 떨어뜨립니다. 해부 현미경과 부드러운 백금 와이어를 사용해 젊은 성체 양성체를 집어 들어보세요.

박테리아를 제거하려면 M9 버퍼로 세척하세요. 선충을 아가로스 패드 위에 옮기고, 할로카본유 방울에 넣으세요. 부드러운 백금 와이어로 선충을 부드럽게 빗질해 고정시키세요.

패드를 마이크로인젝션 스테이지에 장착하세요. 한 쪽 생식샘 팔을 찾아 바늘로 관통하세요. 주입기의 클린 기능을 사용해 생식선 흐름이 보이도록 99 px 인치의 주사 혼합물을 전달하여 시약이 융합체에 접근하는지 확인하세요.

가능하다면 단계를 재배치하고 두 번째 생식선암도 비슷하게 주입하세요. 주사 직후에는 주입된 동물을 아가로스 패드 위에 1에서 2마이크로리터 M9 완충제에 재현탁합니다. 얇은 백금 와이어로 주입된 벌레를 패드에서 떼어내고, M9 버퍼로 오일을 씻어낸 뒤, Comamonas aquatica가 뿌려진 회수 NGM 플레이트에 복원하세요.

회수판을 하룻밤 25도 섭씨에서 배양하세요. 다음 날, 주입된 P0 선충을 Xenorhabdus griffiniae가 씨앗 시딩된 개별 NGM 플레이트에 분리합니다. 두 개의 CRISPR RNA가 이전에 발표된 PAM 부위에서 unc-22의 Steinernema 자웅동체 상동체를 표적으로 설계하였습니다.

니코틴에 노출된 선충에 대한 저크 분석에서는 unc-22 돌연변이체와 야생형 선충 사이에 뚜렷한 운동 차이가 나타났다. PCR을 이용한 경련 자손의 유전형 분석 결과, Pam 3와 Pam 5 모두 표적 부위에 여러 개의 희미한 띠가 나타났습니다. 시퀀싱 결과 목표 unc-22 부위에서 삽입 및 결실 사건이 확인되었습니다.

저희 연구실은 EPN 유전학 분야의 박사후 연구를 확장했습니다. CRISPR는 현재 세 종의 Steinernema에서 이용 가능합니다. 이 프로토콜에서는 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 이용해 안정적이고 유전 가능한 돌연변이를 효율적으로 생성하는 기법을 확립했습니다.

안정적인 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 통해 Steinernema-Xenorhabdus 공생의 분자 메커니즘을 해부할 수 있습니다.