고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출 분석

우리는 HDL 매개 관상동맥 플라크 지질 제거 효과를 측정하여 관상동맥 질환 위험을 평가하는 대리 검사법을 개발했습니다. 현재의 과제는 연구와 임상 응용 모두를 위한 간단하고 빠르며 견고한 HDL 지질 유입 분석 법을 개발하는 것입니다. 먼저, 화학 훈기 후드 아래 유리잔에 필요한 모든 성분을 넣고, 지질 혼합물을 잠시 소용돌이로 섞어 혼합하세요.

혼합물을 유리관 안에서 부드러운 질소 흐름 아래 1시간 건조시켜 튜브 바닥에 건조한 지질막을 형성합니다. 칼슘 규산염 하이드레이트를 코팅할 때, 건조된 지질이 담긴 유리관에 무게 측정용 종이 콘을 삽입하고, 원뿔을 이용해 분말을 바닥으로 유도해 80밀리그램의 칼슘 규산염 하이드레이트 분말을 튜브에 넣습니다. 즉시 튜브에 2밀리리터의 생리식염수를 추가하고 상단에 파라필름을 덮으세요.

손으로 유리관을 소용돌이로 만들어 바닥의 지질 대부분을 떼어내세요. 유리관을 소용돌이에 부착한 스티로폼 플랫폼에 뚫린 구멍에 넣고, 강화 테이프로 튜브를 소용돌이 플랫폼에 고정하세요. 유리관을 10분간 보텍스(Vortex)하여 관 벽에 지질이 남아 있지 않은지 확인하세요.

유리관 내용물을 1밀리리터 피펫을 사용해 15밀리리터 원뿔형 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 유리관을 3밀리리터의 식염수로 세척한 후 같은 15밀리리터 튜브로 세척을 옮깁니다. 다음으로, 지질 코팅된 칼슘 규산염 하이드레이트가 들어 있는 15밀리리터 플라스틱 튜브를 원심분리기에 넣고 935G에서 4도 섭씨에서 2분간 돌립니다.

길고 가는 피펫 팁을 사용해 상원액을 흡인하세요. 상액 상단에서부터 흡입하면서 피펫 끝을 튜브 옆면을 천천히 미끄러뜨립니다. 흡인 시 튜브를 약간 기울이고, 펠릿을 방해하지 않도록 약 200마이크로리터의 식염수를 남겨두세요.

그 다음 식염수를 추가해 총 부피를 5밀리리터로 만듭니다. 원심분리와 상상액 제거를 네 번 반복합니다. 최종 세척 후에는 식염수를 추가하여 총 부피를 2.5밀리리터로 만듭니다. 샘플 세트에 필요한 웰 수에 따라 0.3밀리리터 96웰 플레이트의 각 웰에 75마이크로리터의 식염수를 피펫 투여합니다.

보텍스: LC-CSH를 3번, 각각 10초씩 들어 넣은 15밀리리터 플라스틱 스톡 튜브입니다. 단일 웰 피펫을 사용해 식염수 함유 웰 오른쪽에 50마이크로리터의 LC-CSH를 분사합니다. 세 개의 우정 후, 다음 세 개의 우물에 분비하기 전에 소용돌이 프로토콜을 반복하세요.

96 웰 플레이트를 180도 회전시켜 웰의 왼쪽이 오른쪽으로 향하게 합니다. 각 웰 오른쪽에 25마이크로리터의 혈장 또는 혈청 샘플을 피펫으로 채취합니다. 양성 대조 웰의 경우, 기준 표준 인간 정상 지혈 혈장 또는 혈청 25마이크로리터를 추가하세요.

다음으로, 96웰 플레이트를 접착 필름으로 단단히 밀봉하고, 37도 섭씨와 분당 1,200회전 속도로 열믹서에서 1시간 동안 어둡게 보관합니다. 배양 후에는 플레이트를 열믹서에서 꺼내 얼음 위에 올려놓으세요. 플레이트를 935G, 섭씨 4도에서 2분간 원심분리하여 공여 입자를 펠릿으로 넣고 전달 반응을 멈추게 합니다.

이제 LC-CSH 펠릿을 방해하지 않고 96웰 플레이트에서 접착 막을 조심스럽게 제거하세요. 반응판에서 50마이크로리터의 상청액을 다중 웰 피펫을 사용해 검은색 96웰 평평한 바닥 폴리스티렌 플레이트의 웰로 옮깁니다. 일반 식염수로 저장소를 채우고 각 우물에 50마이크로리터의 식염수를 추가하세요.

멀티웰 피펫을 사용했습니다. 125밀리리터 플라스틱 얼렌마이어 플라스크에 1%의 트리톤 X-100을 준비하세요. 준비된 1% Triton X-100을 저장소에 채우고, 각 우물에 실온에서 같은 용액 100마이크로리터를 추가합니다.

멀티웰 피펫으로 위아래로 부드럽게 파이프를 두세 번 섞고, 3밀리리터 트랜스퍼 피펫의 공기로 기포를 터뜨립니다. 마지막으로, 여기 540나노미터, 방출 600나노미터 형광계를 사용하여 리사민 로다민 형광을 측정합니다. LC-CSH 표지된 직속 희석 LRHPE를 사용해 표준 곡선을 생성했으며, 매우 선형적인 형광 반응을 보였습니다.

혈장 농도 곡선 연구에서는 식염수 대조군과 함께 3중 우물에 쌓인 인간 혈장의 양을 증가시키는 양을 투여했습니다. 혈장 선량 반응 곡선은 PE, 암플럭스, 혈장 부피 간에 우수한 선형성을 보였으며, 15-35 마이크로리터 범위에서 강한 상관관계를 보였습니다. 저희의 간단하고 신속한 프로토콜은 심혈관 질환 발생 위험을 예측하며, 연구와 임상 진단 연구 모두에 활용할 수 있습니다.

우리의 연구 결과는 심혈관 질환에서 세포 및 세포 외 플라크 지질의 역할을 밝힐 수 있음을 보여줍니다.